阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀對成骨細胞增殖及分化的影響

周皖舒 陶周善

1. 皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蕪湖 241000 2. 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

人口老齡化是當今世界一個突出性的社會問題，作為與其相關(guān)的疾病越來越引起世界的關(guān)注，骨質(zhì)疏松就是其中最常見的一種。由于骨吸收的增加或骨形成的減少，在這種重塑過程中的不平衡導致骨質(zhì)疏松癥，容易出現(xiàn)脆性骨折，主要包括髖部、脊椎、前臂以及肱骨骨折，是骨質(zhì)疏松癥最嚴重的并發(fā)癥之一[1]。對于骨質(zhì)疏松癥合并髖部骨折的患者，約30%的患者經(jīng)歷了髖骨骨折的肢體功能減退或者喪失[2]，超過20%的患者在骨折后6～12個月內(nèi)死亡[3]。 隨著亞洲老齡人口的增加，該地區(qū)髖部骨折的發(fā)病率預計將從1990年到2050年增加到世界總量的1/4左右[4-5]。此外，一半的亞洲老年人口是中國人，占世界老年人口的20%。因此，對中國來說，預防和治療骨質(zhì)疏松癥是一項嚴重的挑戰(zhàn)[6]。但目前對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療仍然不夠有效。近年來的研究已經(jīng)證明，辛伐他汀(simvastatin，SIM)還能提高骨密度，促進成骨、增加松質(zhì)骨骨量及抑制骨吸收的作用[7]。近年來，流行病學研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林(aspirin，ASP)可提高老年人的骨密度[8]，這表明其可以用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。近年的研究表明SIM及ASP都是促進成骨及抑制破骨來治療骨質(zhì)疏松的，這表明SIM聯(lián)合ASP有疊加促進骨質(zhì)疏松癥的潛力。鑒于此，是否SIM聯(lián)合ASP治療骨質(zhì)疏松癥具有優(yōu)于單獨治療骨質(zhì)疏松癥的潛力，因此本文研究SIM聯(lián)合ASP刺激成骨細胞，觀察其對成骨細胞增殖分化的影響，探討其對骨質(zhì)疏松癥治療的可行性細胞學基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

取出生24 h的SD大乳鼠作為原代成骨細胞來源，由皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 實驗材料

ASP(AstraZeneca公司)，SIM(默沙東，美國)，DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司)；I 型膠原酶(Sigma公司)；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TritonX-100(Sigma公司)。

1.3 成骨細胞傳代培養(yǎng)

大鼠成骨細胞培養(yǎng)液使用DMEM，含有10%小牛血清，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 U/mL)，細胞培養(yǎng)在 37 ℃、含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，待細胞生長覆蓋瓶底80%時進行傳代。

1.4 ASP及 SIM共培養(yǎng)對成骨細胞的影響

1.4.1采用MTT法檢測成骨細胞增殖情況：實驗分為4組：ASP組、SIM組、ASP-SIM組及對照組(CON)。用0.25%胰蛋白酶消化單層細胞，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，共4列，培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察，待大多數(shù)成骨細胞貼壁伸展后，棄去孔內(nèi)液體，用無血清的DMEM沖洗數(shù)次，加1% FBS 的DMEM 200 μL。一列孔加入2 mmol/L的ASP(ASP組)，一列孔加入1 mmol/L的SIM(SIM組)，一列孔同樣加入2 mmol/L的ASP，24 h后再加入1 mmol/L的SIM (ASP-SIM組)，一列孔為對照組，不加誘導液，3 d 換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)到7 d。加入10% MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)細胞 2 h，棄去細胞培養(yǎng)液，并加入DMSO(100 μL/孔)輕微震蕩，采用比色法通過酶標儀檢測A 490值。

1.4.2茜素紅染色及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定：待上述成骨細胞細胞培養(yǎng)7 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，加入10% 福爾馬林固定10 min。棄固定液，0.1%茜素紅在37 ℃下染色5 min，流水沖洗，流水沖洗后換固定液，拍照記錄結(jié)果。ALP活性采用 PNPP 法測定，細胞培養(yǎng)7 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，1%Triton X-100 反復凍融3次，細胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中30 min，室溫37 ℃，然后加入1 mol/L的NaOH 終止反應(yīng)，405 nm下測定吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標準化的Sigma 校正曲線，計算酶活性。

1.4.3成骨細胞OCN及Runx2的表達檢測：按上述方案培養(yǎng)到7 d，提取細胞總蛋白，加熱變性后，于-20 ℃保存。取蛋白30 μL，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉濾膜4 h，依次結(jié)合相應(yīng)濃度的抗OCN抗體，抗Runx2抗體和抗GAPDH抗體(1∶1000)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/兔抗鼠(1∶2000)，孵育1 h。用化學發(fā)光法曝光膠片，沖洗顯色，檢測相應(yīng)蛋白條帶。用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，多組間細胞蛋白含量、ALP定量及茜素紅定量結(jié)果采用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用 LSD-t法；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 茜素紅染色及堿性磷酸酶活性

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，各組細胞茜素紅染色及堿性磷酸酶染色的結(jié)果如圖1A、1B所示，定量結(jié)果如圖1C、1D所示，結(jié)果表明ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理的成骨細胞的礦化能力及活性明顯增加，相對于對照組，實驗組的成骨細胞礦化能力及ALP活性明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細胞鈣化能力最強及ALP活性最高，這表明ASP聯(lián)合SIM對成骨細胞礦化能力及活性影響明顯優(yōu)于單獨使用的效果。

2.2 共培養(yǎng)對成骨細胞增殖的影響

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，MTT檢測的結(jié)果如圖1E所示，相對于對照組，實驗組的成骨細胞數(shù)目明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細胞數(shù)目最多，這表明ASP聯(lián)合SIM對成骨細胞增殖影響明顯優(yōu)于單獨使用的效果。

2.3 成骨細胞OCN及Runx2的表達

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，各組細胞OCN及Runx2蛋白表達的結(jié)果如圖1F所示，定量結(jié)果如圖1G、1H所示，結(jié)果表明ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM處理的成骨細胞的OCN及Runx2蛋白表達明顯增加，相對于對照組，實驗組的成骨細胞OCN及Runx2蛋白表達明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細胞OCN及Runx2蛋白表達量最多，這表明ASP聯(lián)合SIM對成骨細胞OCN及Runx2蛋白表達影響明顯優(yōu)于單獨使用的效果。

3 討論

本研究通過ASP聯(lián)合SIM使用來干預大鼠成骨細胞，觀察對成骨細胞增殖、鈣化能力及細胞活性和OCN及Runx2蛋白表達情況來研究聯(lián)合使用的可行性，通過藥物和成骨細胞共培養(yǎng)7 d，各組大鼠成骨細胞增殖情況、礦化能力及活性以O(shè)CN及Runx2蛋白表達情況被檢測。結(jié)果表明相對ASP及SIM單獨使用的效果，聯(lián)合使用的效果更佳，能極大提高成骨細胞增殖能力，增加成骨細胞的功能如礦化，同時明顯增加OCN及Runx2蛋白表達，這些結(jié)果表明ASP聯(lián)合SIM來干預大鼠成骨細胞有一定潛力，為臨床上聯(lián)合使用治療骨質(zhì)疏松癥提供細胞學基礎(chǔ)。

辛伐他汀屬于3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，能減少膽固醇合成及穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]。近年來的研究已經(jīng)證明，SIM還能提高骨密度，促進成骨、增加松質(zhì)骨骨量及抑制骨吸收的作用[7]。體外實驗表明SIM可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，改善人或動物成骨細胞系的成骨[10-11]。此外，已經(jīng)證明他汀類通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)的基因表達來增強血管生成[12]，同時VEGF和FGF-2都能間接誘導BMP-2的表達來刺激成骨細胞增殖分化來促進成骨[11]。SIM已被證明對體內(nèi)骨形成和骨礦物質(zhì)密度具有積極作用[13]，進一步研究表明局部應(yīng)用SIM可以促進去卵巢大鼠的骨折愈合[14]。這些研究表明他汀類藥物對骨質(zhì)疏松癥的防治有巨大的潛力。

阿司匹林作為一種經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛藥，由于其有抗凝血、消炎等作用，從而應(yīng)用于心腦血管疾病中，降低心腦血管疾病的發(fā)生率及死亡率。近年來，流行病學研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可提高老年人的骨密度[8]，這表明其可以用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。動物實驗進一步證實阿司匹林可以有效促進大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)的骨密度[15]。有研究表明阿司匹林還可以促進去勢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合，增加骨質(zhì)的骨密度和生物力學強度[16]，主要通過抑制骨吸收及刺激骨形成發(fā)揮作用。同時阿司匹林是一種老藥，不但副作用較少、廉價，而且治療疾病的范圍廣，同時在治療骨質(zhì)疏松癥方面有著獨特的潛力。

在患有嚴重骨質(zhì)疏松癥的患者中，抗骨質(zhì)疏松癥的聯(lián)合療法比單獨的每種療法預期可以更好地改善骨礦物質(zhì)密度。阿司匹林和辛伐他汀在治療心血管疾病方面有著良好的表現(xiàn)，兩者都能通過促進成骨抑制骨吸收來提高骨密度，這些結(jié)果似乎可以得到一個假設(shè)，阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀使用可以影響成骨細胞的增殖分化來促進成骨。本研究證實了這個假設(shè)，ASP聯(lián)合SIM能極大提高成骨細胞的增殖能力，增加成骨細胞的功能如礦化，同時明顯增加OCN及Runx2蛋白的表達，這些結(jié)果表明ASP聯(lián)合SIM來干預大鼠成骨細胞有一定潛力，從成骨細胞學基礎(chǔ)上證實其聯(lián)合治療骨質(zhì)疏松癥的可行性。