響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取牡丹籽殼低聚茋類化合物的工藝研究

劉丹丹，鄭旭煦,，殷鐘意，衡銀雪(.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶400067； .重慶工商大學(xué) 催化與功能有機(jī)分子重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400067)

牡丹屬于芍藥科芍藥屬多年生落葉小灌木，牡丹籽可榨油，牡丹籽油于2011年3月被衛(wèi)生部列入新資源食品。隨著牡丹籽油的開發(fā)利用，其加工副產(chǎn)物牡丹籽殼常常被直接丟棄，不僅增加固體廢棄物負(fù)荷，還造成資源的浪費(fèi)。已有學(xué)者對牡丹籽殼的成分進(jìn)行研究，其中含有低聚茋類化合物。低聚茋類化合物是一種由1,2-二苯乙烯為單體聚合而成的化合物，結(jié)構(gòu)獨(dú)特且復(fù)雜，具有抗氧化[1]、抗癌[2-4]、保肝[5-6]、抗病毒[7-9]、降血糖[10-11]、降血脂[12-13]等生物活性。目前，對牡丹籽殼中低聚茋類化合物的研究較少，對其生物活性了解不多，故本研究采用超聲波輔助甲醇提取工藝對牡丹籽殼中的低聚茋類化合物進(jìn)行提取，并優(yōu)化提取工藝，為牡丹籽殼的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽：60℃烘干至恒重，含水率低于5%，機(jī)械脫殼后將牡丹籽仁及牡丹籽殼分離，牡丹籽殼粉碎后過40目篩，避光保存于干燥罐中。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DFY-1000搖擺式高速萬能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；Infinite 200酶標(biāo)儀：帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；TDZ4A-WS低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低聚茋類化合物的提取

精確稱取牡丹籽殼粉末1.000 0 g±0.000 5 g，加入不同液料比、不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，將上清液減壓蒸發(fā)揮去甲醇，剩余浸膏60℃烘干，避光保存于干燥罐中。

1.2.2 低聚芪類化合物含量測定

采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測定低聚茋類化合物的含量。于750 nm處進(jìn)行測定，以吸光值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.122 76x+0.001 92(R2=0.999 3)。提取物中低聚茋類化合物的含量以沒食子酸當(dāng)量表示。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測定

用50%乙醇配制不同質(zhì)量濃度的提取物，用移液槍吸取100 μL與100 μL 0.04 mg/mL DPPH溶液加入96孔板，搖勻后室溫避光放置20 min后在波長517 nm處測定吸光值(A1)，取100 μL 0.04 mg/mL DPPH溶液和100 μL 50%乙醇混合，同樣方法測定吸光值(A0)，再取100 μL無水乙醇與100 μL不同質(zhì)量濃度提取物溶液混合，相同方法測定吸光值(A2)[15-16]。低聚芪類化合物對DPPH自由基的清除率為：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.2.4 亞鐵離子還原能力(FRAP)測定

繪制硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線：取2.78 g硫酸亞鐵以水定溶于100 mL容量瓶，加入小鐵釘。將溶液稀釋到0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L，各取20 μL置于96孔板，并加入180 μL預(yù)熱到37℃的FRAP工作液，混勻后于波長593 nm處測定吸光值[17]，以亞鐵離子濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為：A=1.138 6C-0.011(R2=0.991 9)。

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液20 μL置于96孔板，并加入180 μL預(yù)熱到37℃的FRAP工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行組，混勻后于波長593 nm 處測定吸光值并取平均值。根據(jù)吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到與之對應(yīng)的亞鐵離子濃度，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以亞鐵離子濃度為縱坐標(biāo)作圖，用亞鐵離子濃度衡量樣品活性，數(shù)值越大則樣品抗氧化活性越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比的影響

固定甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50℃、提取時(shí)間30 min，在液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1條件下分別對原料進(jìn)行提取，考察液料比對得率的影響，做3組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對低聚茋類化合物得率的影響

由圖1可知，低聚茋類化合物得率在13.35%～14.65%之間變動(dòng)，液料比10∶1時(shí)得率最低，之后開始增加，20∶1～50∶1之間變動(dòng)不大，波動(dòng)在0.2%以內(nèi)，低液料比會(huì)導(dǎo)致提取物不能完全溶解于溶劑中，隨著液料比的增加提取物可以完全溶解。因此，在保證提取效率同時(shí)考慮到節(jié)約溶劑問題，液料比選擇20∶1。

2.1.2 提取時(shí)間的影響

固定液料比20∶1、提取溫度50℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，將提取時(shí)間定為10、20、30、40、50 min，考察提取時(shí)間對得率的影響，做3組平行試驗(yàn)。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，低聚茋類化合物得率先增加，在40 min處達(dá)到峰值(15.67%)，之后開始下降。這是因?yàn)樘崛∥锏慕鲂枰欢ǖ臅r(shí)間，若提取時(shí)間過短則會(huì)造成浸出不完全而得率低，隨提取時(shí)間延長提取物不斷浸出所以得率升高，但是超聲波具有空化作用，提取時(shí)間過長會(huì)對提取物的結(jié)構(gòu)造成破壞。因此，提取時(shí)間選擇40 min。

圖2 提取時(shí)間對低聚茋類化合物得率的影響

2.1.3 提取溫度的影響

固定液料比20∶1、提取時(shí)間40 min、甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，將提取溫度設(shè)定為30、40、50、60、70℃，考察不同提取溫度對得率的影響，做3組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對低聚茋類化合物得率的影響

由圖3可知，牡丹籽殼中低聚茋類化合物得率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)從8.9%開始上升后在60℃達(dá)到最高(17.1%)之后下降的趨勢，這是因?yàn)闇囟葧?huì)對提取物的溶出速度造成影響，溫度升高有利于提取物的溶出，但溫度過高會(huì)破壞提取物的結(jié)構(gòu)。因此，提取溫度選擇60℃。

2.1.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響

固定液料比20∶1、提取時(shí)間40 min、提取溫度60℃，考察不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響，體積分?jǐn)?shù)從50%～90%平均設(shè)定5個(gè)水平，做3組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖4。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對低聚茋類化合物得率的影響

由圖4可知，低聚茋類化合物得率隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在15.7%～17.4%之間變化，在甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到峰值，因?yàn)椴煌w積分?jǐn)?shù)的甲醇具有不同的極性，牡丹籽殼中的低聚茋類化合物的極性與70%甲醇最為接近。因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、甲醇體積分?jǐn)?shù)(D)為考察因素，以低聚茋類化合物得率(Y)為考察指標(biāo)，按照Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平見表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面因素水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到牡丹籽殼低聚茋類化合物得率方程為：

Y=17.54+0.97A-0.035B+0.21C-0.22D+0.28AB+0.25AC-0.43AD+0.47BD-1.19A2-1.38B2-0.51C2-1.46D2-0.21A2C+1.02A2D-0.84AB2+0.57B2D-1.41A2C2

由表3可以看出，擬合模型極顯著(P<0.000 1)，R2為0.987 0，校正后的R2為0.967 0，F(xiàn)值為 49.24，都表明模型合理。C、AB是顯著因素，A、AD、BD、A2、B2、C2、D2、A2D、AB2、B2D、A2C2是極顯著因素，失擬項(xiàng)的F值為4.21，表明失擬項(xiàng)都是由誤差造成，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.091 5)。由F值可看出，4個(gè)因素對低聚茋類化合物得率的影響順序?yàn)锳>C>D>B，即液料比>提取溫度>甲醇體積分?jǐn)?shù)> 提取時(shí)間。模型信噪比為 26.819 大于4，模型可用于擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行預(yù)測，得到最優(yōu)工藝條件為：液料比21.9∶1，提取時(shí)間40 min，提取溫度62℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)70.5%，預(yù)測得率為17.76%。對此預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)條件為：液料比22∶1，提取時(shí)間40 min，提取溫度62℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，平行測定3次，所得結(jié)果平均值為17.68%，與預(yù)測結(jié)果基本吻合，說明經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取條件可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 DPPH自由基清除率(見圖5)

圖5 樣品與維生素C的DPPH自由基清除率

由圖5可知，維生素C與牡丹籽殼低聚茋類化合物都有一定的DPPH自由基清除效果，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，即隨樣品質(zhì)量濃度增高，DPPH自由基清除效果增強(qiáng)。牡丹籽殼低聚茋類化合物對DPPH自由基的清除效果在低于100 μg/mL時(shí)比維生素C強(qiáng)，高于100 μg/mL時(shí)，維生素C的DPPH自由基清除率更高。

2.4 亞鐵離子還原能力(見圖6)

圖6 樣品與維生素C的亞鐵離子還原能力

由圖6可知，牡丹籽殼低聚茋類化合物與維生素C的亞鐵離子還原能力都與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨質(zhì)量濃度增加其還原能力增加，牡丹籽殼低聚茋類化合物的亞鐵離子還原能力不如維生素C強(qiáng)，質(zhì)量濃度低時(shí)相差不大，質(zhì)量濃度越高相差越大。

由于測定亞鐵離子還原能力時(shí)，需要在酸性條件下進(jìn)行，而低聚茋類化合物都帶有酚羥基，在酸性條件下容易反應(yīng)導(dǎo)致變性，所以與維生素C對照，低聚茋類化合物對亞鐵離子還原能力要比對DPPH自由基清除能力低。

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對牡丹籽殼低聚茋類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的工藝條件為：液料比22∶1，提取時(shí)間40 min，提取溫度62℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%。在最佳條件下，牡丹籽殼低聚茋類化合物得率為17.68%。

油用牡丹籽殼中的低聚茋類化合物具有一定的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率與維生素C相當(dāng)，亞鐵離子還原能力低于維生素C。

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