微生物發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白多肽菜籽粕的研究

孫 林，劉 平，卓偉偉，方 霞，范海霞，吳海明(.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，江西 樟樹 3300； .江西四特酒業(yè)有限責(zé)任公司，江西 樟樹 3300)

我國是世界上主要的油菜生產(chǎn)國，每年榨油產(chǎn)生的菜籽粕約600萬t，菜籽粕中含有35%～45%的蛋白質(zhì)[1]。菜籽粕中蛋白質(zhì)含量豐富，但在畜禽養(yǎng)殖中作為蛋白質(zhì)飼料添加量卻遠(yuǎn)低于大豆粕，主要原因一是菜籽粕中含有大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子，二是菜籽粕中蛋白質(zhì)的消化率較低[2]。目前，國內(nèi)外對菜籽粕的研究多集中在去除抗?fàn)I養(yǎng)因子方面[3-5]，對提高菜籽粕消化率的研究還較少。

目前，提高菜籽粕消化率主要通過降低菜籽粕中纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)含量和提高菜籽粕中蛋白質(zhì)分解的多肽類物質(zhì)含量來實(shí)現(xiàn)[6]。國內(nèi)外采用的方法主要有物理處理法[7]、化學(xué)處理法[8]、酶處理法[9-10]、微生物發(fā)酵法[11]。微生物發(fā)酵法相對于其他方法具有成本低、營養(yǎng)損失少、操作簡單、無污染等特點(diǎn)，是理想的提高菜籽粕蛋白質(zhì)含量和多肽含量的方法。

本研究利用前期篩選的對菜籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子去除作用明顯的植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌[5，12]加上黑曲霉菌對菜籽粕進(jìn)行單菌和混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究各菌種對菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量的影響，選出最佳的菌種組合和發(fā)酵條件，以獲得低毒、高蛋白多肽的菜籽粕飼料，為菜籽粕的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

植物乳酸菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為本校實(shí)驗(yàn)室前期篩選的對菜籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子去除作用明顯的保存菌種。黑曲霉菌(Aspergillusniger)由江西四特酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 原料

菜籽粕：由江西金佳谷物股份有限公司提供，水分含量11.2%,粗蛋白質(zhì)含量36.2%，多肽含量1.11%，硫甙含量96.526 μmol/g，粉碎過40目篩備用。

麩皮：本地市售，含水量11.8%，粗蛋白質(zhì)含量15.1%，粉碎過40目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

植物乳酸菌為MRS培養(yǎng)基，黑曲霉菌為察氏培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子及種子液的制備

將保存的菌種斜面接2環(huán)到各菌種增殖培養(yǎng)基。植物乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基，38℃，靜置培養(yǎng)48 h；枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；黑曲霉菌接種到察氏培養(yǎng)基，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；從上述增殖菌液中，以5%的接種量分別接到各菌的發(fā)酵種子培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分同各菌增殖培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

首先制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。將菜籽粕、麩皮(按添加量9∶1的配比)裝入200 mL三角瓶中，攪拌均勻，按不同的水料比加入水，塞緊棉塞，裹牛皮紙封口，115℃滅菌20 min，出鍋冷卻后打散備用。其次將各菌種的發(fā)酵種子液以不同的接種量加入滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，封口發(fā)酵。發(fā)酵過程中定時(shí)取樣，烘干粉碎，測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量。

1.2.3 單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2方法分別將各菌以6%接種量接入成分相同的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(水料比1.5∶1)中，溫度34℃進(jìn)行單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵48 h時(shí)采樣測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量。

1.2.4 混菌發(fā)酵菌種組合正交實(shí)驗(yàn)

將3種菌種按3種接種量進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，水料比1.5∶1、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間24 h 等發(fā)酵條件不變，采用L27(313)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量為指標(biāo)確定混菌發(fā)酵菌種的最佳組合和接種比例，研究影響混菌發(fā)酵效果的主次菌種。

1.2.5 混菌發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)

設(shè)定水料比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間的三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，采用混菌發(fā)酵選出的最佳菌種組合和接種比例，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量為指標(biāo)確定發(fā)酵條件各因素對混菌發(fā)酵效果的影響，優(yōu)化混菌發(fā)酵的條件。

1.2.6 相關(guān)指標(biāo)測定

粗蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法[13]。多肽含量的測定:三氯乙酸法(TCA法)[14]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SAS9.0 軟件中的ANONA和GLM語句的方差分析程序；多重比較采用Duncan進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.1.1 各菌種對發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響(見圖1)

圖1 各菌種對發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1所示，各菌種對發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量均有一定的提高，其中以黑曲霉菌發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到38.4%,相對于空白樣(粗蛋白質(zhì)含量34.09%)提高4.31個(gè)百分點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量也較高，達(dá)到37.9%。這可能與黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的酶系含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、多糖酶等有關(guān)[15-17]，其能夠分解纖維素和木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)生產(chǎn)菌體蛋白，同時(shí)提高蛋白質(zhì)在菜籽粕中的相對含量。

2.1.2 各菌種對發(fā)酵菜籽粕多肽含量的影響(見圖2)

圖2 各菌種對發(fā)酵菜籽粕多肽含量的影響

由圖2所示，各菌種對菜籽粕多肽含量均有一定的影響，黑曲霉菌發(fā)酵菜籽粕中多肽含量最高，達(dá)到3.682%，相對于空白樣1.002%，提高2.68個(gè)百分點(diǎn)。其次為枯草芽孢桿菌，多肽含量最低的為植物乳酸菌。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉具有較高的分泌蛋白酶的能力[18-19]，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)一步分解為多肽類物質(zhì)，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相同?？莶菅挎邨U菌同樣具有分泌蛋白酶的特性[20-21]，其發(fā)酵菜籽粕中多肽含量僅次于黑曲霉菌。植物乳酸菌發(fā)酵菜籽粕中多肽含量最低，這可能與植物乳酸菌的酶系以糖酶、脂肪酶、產(chǎn)酸酶為主[22]，對蛋白質(zhì)的分解能力較差，無法將菜籽粕中的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分解為多肽類物質(zhì)。

2.2 混菌發(fā)酵菌種組合正交實(shí)驗(yàn)

按照1.2.4實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行混菌發(fā)酵菌種組合正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1, 混菌發(fā)酵菌種組合L27(313)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 混菌發(fā)酵菌種組合正交實(shí)驗(yàn)因素水平

由表2所示，3種菌對菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量的影響主次順序?yàn)椋汉谇咕?枯草芽孢桿菌>植物乳酸菌，說明黑曲霉菌對提高菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量的作用最明顯，枯草芽孢桿菌次之，植物乳酸菌最差，這與單菌發(fā)酵效果相符。3種菌對菜籽粕中多肽含量的影響主次順序?yàn)椋汉谇咕?枯草芽孢桿菌>植物乳酸菌，說明黑曲霉菌對提高菜籽粕中多肽含量的作用最大，枯草芽孢桿菌次之，植物乳酸菌最差，與單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 混菌發(fā)酵菌種組合L27(313)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用SAS9.0對上述正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3所示，在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的各菌種中，黑曲霉菌的影響達(dá)到差異顯著水平(P<0.05),其他各菌種的影響未達(dá)到差異顯著水平(P>0.05),說明黑曲霉菌是混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的主要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的菌種組合中黑曲霉菌是必備的。各菌種在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響中沒有顯著的交互作用。

表3 混菌發(fā)酵菌種組合 L27(313)正交實(shí)驗(yàn)方差分析

在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的各菌種中，黑曲霉菌的影響達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)，枯草芽孢桿菌的影響達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，說明提高菜籽粕多肽含量主要受黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的影響，植物乳酸菌的影響未達(dá)到差異顯著水平(P>0.05)。各菌種在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的影響中沒有顯著的交互作用。因此，混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量需要添加黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌。

綜合考慮，混菌發(fā)酵中黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌對提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量作用明顯，是必須添加的。因此，選擇黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌接種量均為6%(表2中的實(shí)驗(yàn)號(hào)18和實(shí)驗(yàn)號(hào)26)。由于植物乳酸菌在前期篩選中對硫甙去除作用明顯，為獲得高蛋白多肽菜籽粕的同時(shí)保證菜籽粕的低毒，選擇按4%接種量添加植物乳酸菌。因此，混菌發(fā)酵菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌，接種量分別為4%、6%、6%。

2.3 混菌發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)

按照2.2選出的最佳菌種組合(植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%)進(jìn)行混菌發(fā)酵接種，按照1.2.5 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行混菌發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)。混菌發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表4,混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表4 混菌發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平

由表5所示，對混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量影響因素最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是水料比，影響最小的是發(fā)酵溫度；各因素的較優(yōu)水平為發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時(shí)間48 h。 混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量影響因素最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是水料比，影響最小的是發(fā)酵溫度；各因素的較優(yōu)水平為發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時(shí)間48 h。

表5 混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用SAS9.0對上述正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表6所示，在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的各因素中，發(fā)酵時(shí)間的影響達(dá)到差異顯著水平(P<0.05),發(fā)酵溫度和水料比的影響差異不顯著(P>0.05)。在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的各因素中，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、水料比的影響均達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)，表明各菌種產(chǎn)蛋白酶分解多肽的過程對各發(fā)酵因素比較敏感。

綜合分析，采用植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%，在發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時(shí)間48 h條件下進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量為42.5%，多肽含量為7.86%。并在上述條件下對菜籽粕發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，結(jié)果見表7。

表7 菜籽粕發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

由表7所示，發(fā)酵后的菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量較發(fā)酵前均有所增加，菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子硫甙含量、植酸含量及單寧含量都較發(fā)酵前大幅下降?？梢姴俗哑山?jīng)混菌發(fā)酵后質(zhì)量得到了提高。

3 結(jié) 論

(1)在單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，菜籽粕經(jīng)植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵48 h后粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量均有提高，其中黑曲霉菌的作用最明顯，菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量分別達(dá)到38.4%和3.682%。

(2)混菌發(fā)酵效果優(yōu)于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵的最佳菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%，優(yōu)化的發(fā)酵條件為水料比1.7∶1、34℃下發(fā)酵48 h 。在上述最優(yōu)條件下菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量 42.5%，多肽含量7.86%,抗?fàn)I養(yǎng)因子硫甙含量降至21.637 μmol/g、植酸含量0.27%、單寧含量0.41 mg/g，得到高蛋白、多肽、低毒的菜籽粕飼料。

[1] 蔣新正.我國大豆、菜籽、花生等油料、油脂、餅粕的供需情況分析[J].中國油脂,2002, 27(6):73-74.

[2] TRIPATHI M K，MISHRA A S.Glucosinolates in animal nutrition：a review[J].Anim Feed Sci Technol，2007，132：1-27.

[3] 彭健，蔣思文.雙低菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)及降低措施[J].中國飼料，2001(14)：7-9.

[4] WU M C,LI X D.Study on removal of glucosinolates ,tennis and phytates from rapeseed meal[M].New York: Science Press New York,2001: 292-298.

[5] 孫林，李呂木，張邦輝,等.多菌種固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24(1)：85-89.

[6] GUO H，KOUZUMA Y，YONEKURA M.Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J].Food Chem，2009，113(1)：238-245.

[7] 嚴(yán)奉偉,吳謀成,江洪,等.菜籽粕綜合提取工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2004,20(3)：209-212.

[8] 嚴(yán)梅榮,王丹丹,鞠興榮.堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2010,25(3)：45-49.

[9] 杜冬梅,郭華,鄒正.酶解菜籽粕制備多肽的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27(11):1344-1348.

[10] 楊雪,李云亮,王禹程,等.酶解法制備菜籽多肽的工藝研究[J].中國飼料，2017(2):19-21.

[11] 何榮海,蔣邊,朱培培,等.枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽及降解硫苷的研究[J].食品工業(yè)科技，2014,35(10):228-233.

[12] 孫林,李呂木,張邦輝,等.多菌種固態(tài)發(fā)酵去除菜籽粕中的植酸[J].中國油脂，2008，33(8)：60-63.

[13] 張麗英.飼料分析與飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：49-53.

[14] 魯偉,任國譜,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學(xué)，2005，26(7)：169-171.

[15] 胡德朋,唐家毅，曹星，等.枯草芽孢桿菌的分離鑒定及酶系分布的研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27(2):86-88.

[16] 戴四發(fā)，賀淹才,謝德鑣，等.黑曲霉液體發(fā)酵分泌纖維素酶系特性的研究[J].糧油食品科技，2004,12(2):36-39.

[17] 劉中美,謝夢圓,周哲敏.黑曲霉-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015,34(11):1198-1202.

[18] 王文娟,宋俊梅,曲靜然.黑曲霉發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶活性的研究[J].中國釀造，2007(5):23-26.

[19] 孫婕,尹國友,陶戰(zhàn)霞,等.黑曲霉發(fā)酵韭菜籽產(chǎn)蛋白酶活力的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2015,36(14):66-71.

[20] 王曉云,王慧,趙燕,等.紫外誘變選育高活性蛋白酶枯草芽孢桿菌及其降解飼料能力評價(jià)[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2016,23(6):77-83.

[21] 李洪康,李由然,李贏,等.枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2016,42(5):102-107.

[22] 沈蓮清,蘇光耀,王向陽.植物乳桿菌素研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006,25(5):121-126.