土壤有效硒測(cè)定方法的研究

陳娥 陳永波 李衛(wèi)東 黃光昱 胡百順 劉淑琴 秦邦 陳燁 熊倩

摘要：采用原子熒光形態(tài)分析法和原子熒光光譜法，檢測(cè)了恩施市不同地點(diǎn)土壤的有效硒，并對(duì)浸提液濃度、液樣比、振蕩時(shí)間、超聲時(shí)間、土壤細(xì)度、浸提液pH等條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了土壤有效硒的提取方法。提取方法為：稱取土壤樣品1.0 g于離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 0.25 mol/L KH2PO4溶液，于30 ℃、1 500 r/min條件下振蕩60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液5 mL消化后上機(jī)測(cè)定，樣品加標(biāo)回收率在90.17%～98.00%。該研究為土壤有效硒測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：原子熒光形態(tài)分析法;原子熒光光譜法;土壤有效硒;提取方法

中圖分類號(hào)：X833? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0022-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.005? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Method for Determination of Available Selenium in Soil

CHEN E，CHEN Yong-bo，LI Wei-dong，HUANG Guang-yu，HU Bai-shun，

LIU Shu-qin，QIN Bang，CHEN Ye，XIONG Qian

（Enshi Selenium Application Technology and Product Development Research Institute，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The atomic fluorescence speciation analysis and atomic fluorescence spectrometry were carried out to detect the available selenium in soil at different locations in Enshi City. Extraction conditions such as concentration of leachate，ratio of liquid to sample，shaking time，ultrasonic time，soil fineness，pH of leachate and other conditions were optimized to establish an effective extraction method of available selenium in soil. The extraction method is as follows，after 1.0 g soil sample is weighed into a centrifuge tube，accurately add 10 mL of 0.25 mol/L KH2PO4 solution，shaken at 30 ℃，1 500 r/min for 60 min，centrifuged at 3 000 r/min for 15 min. and take 5 mL supernatant for digestion. After digestion，the recovery of the sample was 90.17%～98.00%. It laid the foundation for the development of standards for soil available selenium determination methods.

Key words： atomic fluorescence speciation analysis; atomic fluorescence spectrometry; available selenium in soil; extraction method

硒是人畜必需的微量元素之一，在環(huán)境中分布分散且不均勻，但對(duì)人類的身體健康具有重要意義。植物是人類補(bǔ)硒的主要來源，植物對(duì)硒的吸收與土壤中硒的形態(tài)有直接關(guān)系[1]。有研究表明，富硒的土壤并不一定能生產(chǎn)出富硒的農(nóng)作物，因?yàn)槲谕寥乐幸远喾N形態(tài)存在，作物能吸收的是有效態(tài)的硒，而總硒含量高的土壤有效硒含量不一定高[2-4]。由于不同形態(tài)硒化學(xué)和生物學(xué)特征不同，因此研究土壤中硒的形態(tài)分布對(duì)闡明硒的生物可利用性甚至整個(gè)生態(tài)環(huán)境具有重要的理論和實(shí)踐意義。由于土壤本身的復(fù)雜性，硒在土壤中存在形態(tài)也呈現(xiàn)相應(yīng)的復(fù)雜性[5]。土壤總硒并非都可以被植物吸收利用，根據(jù)瞿建國(guó)等[6-8]、朱英等[9]的研究，土壤硒分為水溶態(tài)、可交換態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)、元素態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、碳化物/硒化物結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)等形態(tài)，其中水溶態(tài)和可交換態(tài)硒可被植物吸收利用，稱為生物有效態(tài)硒[10，11]。一般用生物有效態(tài)硒來反映土壤供硒能力更準(zhǔn)確[12]。

目前，關(guān)于土壤有效硒的研究還沒有統(tǒng)一的測(cè)定方法。一般采用KCl溶液[13]、KH2PO4溶液[14，15]、KH2PO4+K2HPO4緩沖液等提取土壤中的有效硒[16]。郭宇等[17]采用順序提取法測(cè)定了富硒巖石中的硒形態(tài)，用去離子水提取水溶性硒，用0.1 mol/L KH2PO4+K2HPO4（pH=7）緩沖液提取可交換態(tài)硒。李輝勇等[18]用0.1 mol/L的KH2PO4適合作酸性水稻土的浸提液。溫國(guó)燦等[19]用0.5 mol/L的NaH2PO4適合作酸性土壤的浸提液，但對(duì)不同類型的土壤浸提沒有形成共識(shí)[20]?；诖耍狙芯坎捎肏PLC-AFS形態(tài)分析法較為系統(tǒng)地研究了不同浸提液提取恩施市蓮花池碎米薺土壤中SeO42-和SeO32-等有效硒的效果，并結(jié)合土壤有效硒含量較低且含有有機(jī)硒小分子的實(shí)際情況，選用0.25 mol/L的KH2PO4作為浸提液，然后再用氫化物-原子熒光光譜法測(cè)定浸提液的總硒作為土壤有效硒的測(cè)定方法，該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，便于推廣應(yīng)用，對(duì)科學(xué)評(píng)價(jià)、開發(fā)、利用土壤硒資源具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

2016年3月，課題組從恩施市雙河楊家堡菜園土、三岔沙子壩水稻土、蓮花池碎米薺土、紅廟西河壩水稻土采集的4個(gè)土壤樣品，采用NY/T 1104-2006標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定總硒含量，結(jié)果見表1。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 土壤中硒的測(cè)定方法? 土壤中有效硒形態(tài)采用高效液相-原子熒光形態(tài)聯(lián)用儀分析測(cè)定[21]，HPLC為美國(guó)Waters 2695分離單元，SAP10+AFS-930由北京吉天有限儀器公司生產(chǎn)。儀器參考條件見表2。

1.2.2? 土壤有效硒浸提方法的研究

1）浸提液的篩選。稱取土壤樣品1602號(hào)（pH 5.34，酸性）、1607號(hào)（pH 7.82，弱堿性）、1608號(hào)（pH 7.51，弱堿性）、1612號(hào)（pH 6.61，弱酸性）各1.0 g于10 mL離心管中，每個(gè)土樣重復(fù)5份，分別準(zhǔn)確加入10 mL去離子水、10 mL 0.25 mol/L的KCl溶液、10 mL 1.0 mol/L的HCl溶液、10 mL 0.1 mol/L KH2PO4溶液和10 mL 0.1 mol/L KH2PO4+K2HPO4緩沖液，于30 ℃、1 500 r/min條件下振蕩60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定SeO32-和SeO42-的含量。

2）KH2PO4溶液濃度對(duì)土壤硒加標(biāo)回收率的影響。做樣品回收率試驗(yàn)選用本底值含量較低的土樣1602號(hào)。稱取1602號(hào)土樣10份，每份1.0 g于10 mL離心管中，分成2組。一組作為對(duì)照，一組加入 1 μg/mL的Se（IV）、Se（VI）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL， 然后準(zhǔn)確加入0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mol/L的KH2PO4溶液10 mL，于30 ℃、1 500 r/min條件下振蕩60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定SeO32-和SeO42-的含量，計(jì)算回收率。

3）液樣比對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響。稱取1608號(hào)土樣0.10～2.00 g于15 mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.25 mol/L KH2PO4溶液10 mL，于30 ℃、1 500? r/min振蕩60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定SeO32-和SeO42-含量。

4）試液隔夜測(cè)定。將浸提液在4 ℃放置過夜，第二天取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定SeO32-和SeO42-含量。

5）振蕩時(shí)間對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響。稱取1608號(hào)1.0 g，準(zhǔn)確加入0.25 mol/L KH2PO4溶液15 mL，于30℃、1 500 r/min振蕩30、60、90、120 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定SeO32-和SeO42-含量。

6）超聲對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響。稱取1608號(hào)樣品1.0 g，準(zhǔn)確加入0.25 mol/L KH2PO4溶液15 mL，分別超聲提取10、20、40、60 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定有效硒含量。

7）振蕩+超聲對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響。稱取1608號(hào)土樣1.0 g于15 mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.25 mol/L KH2PO4溶液10 mL，于30 ℃、1 500 r/min振蕩60 min，超聲10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定有效硒含量。

8）土壤細(xì)度對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響。稱取不同細(xì)度的1608號(hào)土壤樣品1.0 g，準(zhǔn)確加入0.25 mol/L KH2PO4溶液10 mL，于30 ℃、1 500 r/min振蕩60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定有效硒含量。

9）浸提液酸堿度對(duì)SeO32-和SeO42-提取率的影響。稱取1608號(hào)樣品1.0 g，準(zhǔn)確加入未調(diào)pH及調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0、8.0的0.1 mol/L KH2PO4溶液10 mL，于30℃、1 500 rpm振蕩提取60 min，3 000? ?r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-AFS分析，測(cè)定有效硒含量。

10）測(cè)定方法加標(biāo)回收。分別稱取土壤1602、1607、1612試樣1.0 g（精確到0.001 g）各12份，分為4組，每組3次重復(fù)。加標(biāo)濃度分別為0.1、0.2、0.4 mg/kg，準(zhǔn)確加入10 mL 0.25 mol/L磷酸二氫鉀溶液;根據(jù)前面確定的最佳提取條件處理后，取上清液5 mL于微波消解罐中，加入HNO3 7 mL、H2O2 1 mL進(jìn)行消解;樣品消解完畢后，在電熱板上160 ℃左右加熱至近干，切記不可蒸干，冷卻后加入5 mL? ?6 mol/L鹽酸，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，消解罐用5%鹽酸溶液洗滌2～3次，溶液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，用5%鹽酸溶液定容，用原子熒光光譜儀測(cè)定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 浸提液的篩選

不同浸提液對(duì)SeO32-和SeO42-的提取效果見表3。從表3可以看出，去離子水、0.25 mol/L KCL溶液、1.0 mol/L HCl溶液均未浸提出土樣1602、1607、1612中SeO32-和SeO42-，只能浸提出土樣1608中水溶性的硒，且提取量分別為40.80、41.44、1.56 mg/kg;0.1 mol/L KH2PO4溶液能夠提出4個(gè)土樣中水溶性的硒，且對(duì)土樣1608中水溶性的硒提取量為81.94 mg/kg;0.1 mol/L KH2PO4+K2HPO4溶液只能提出土樣1602、1607、1612中的SeO32、SeO42-未檢出，對(duì)土樣1608中水溶性的硒提取量為82.89 mg/kg，與0.1 mol/L KH2PO4溶液對(duì)土樣1608中水溶性的硒提取量差異不顯著。因此選擇0.1 mol/L的KH2PO4溶液做浸提液。由于在所選4個(gè)土壤樣品中1608號(hào)土樣的有效硒含量最高，所以有效硒提取條件的探索選用1608號(hào)土樣。

2.2? KH2PO4溶液濃度對(duì)土壤硒加標(biāo)回收率的影響

不同濃度的KH2PO4溶液對(duì)土壤硒加標(biāo)回收率的影響見表4。由表4可以看出，隨著KH2PO4溶液濃度的提高，本底值濃度也逐漸增高;SeO32-回收率先增加后降低。當(dāng)KH2PO4溶液濃度為0.25 mol/L時(shí)，SeO32-回收率最高為69.0%;SeO42-回收率均在80.0%以上，但配置1.0 mol/L KH2PO4溶液時(shí)已難以完全溶解，考慮到實(shí)際土壤中鹽不可能達(dá)到這么高的濃度，最后選擇濃度為0.25 mol/L KH2PO4溶液作為土壤有效硒的浸提液。

2.3? 液樣比對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

用0.25 mol/L KH2PO4溶液作為土壤有效硒的浸提液，取1608土樣0.10～2.00 g進(jìn)行SeO32-和SeO42-提取，結(jié)果見表5。從表5可以看出，液樣比大約在10～100，SeO32-提取量穩(wěn)定，液樣比大于40時(shí)，SeO42-提取量降低;小于10，SeO32-提取量下降。綜合考慮，液樣比宜在10～40，稱樣量宜在0.25～1.00 g，含硒量較高的土壤可稱取0.25 g，一般樣品稱取0.50～1.00 g，稱樣量太大，提取率反而下降。

2.4? 試液隔夜測(cè)定結(jié)果

將2.3中的試液在冰箱放置過夜后，測(cè)定結(jié)果見表6，與表5相比，SeO32-含量升高，SeO42-含量明顯下降，可能是SeO42-被還原成SeO32-所致，因此，制備的樣品宜當(dāng)天測(cè)定。

2.5? 振蕩時(shí)間對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

稱取1608號(hào)土樣1.0 g，加入0.25 mol/L KH2PO4溶液，檢測(cè)振蕩時(shí)間對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響，結(jié)果見表7。從表7可知，振蕩30 min時(shí)間太短，提取率極低;60～90 min，提取率升高;90～120 min，提取率趨于穩(wěn)定，因此在未知土壤有效硒含量的情況下，振蕩時(shí)間以60～90 min為宜。

2.6? 超聲時(shí)間對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

在不同超聲時(shí)間下對(duì)1608號(hào)土樣進(jìn)行有效硒含量測(cè)定，結(jié)果見表8。從表8可以看出，超聲20 min提取量最高。延長(zhǎng)超聲時(shí)間，效果不明顯，但超聲提取量較振蕩提取60～90 min低。

2.7? 振蕩+超聲對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

從表9可以看出，振蕩時(shí)間為30 min時(shí)，超聲10 min可以明顯提高SeO32-和SeO42-的浸出量;振蕩60 min后，超聲10 min對(duì)提取量影響效果不明顯。振蕩30 min+超聲10 min的提取率較振蕩60 min低，因此宜選用振蕩60 min+超聲10 min的提取方法。

2.8? 土壤細(xì)度對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

由表10可知，土壤細(xì)度為40目時(shí)，SeO32-提取率較低，但不影響SeO42-的提取，大于60目時(shí)，SeO32-和SeO42-提取量均趨于穩(wěn)定，因此土壤細(xì)度應(yīng)為60～100目。

2.9? 浸提液pH對(duì)SeO32-和SeO42-提取量的影響

由表11可知，浸提液的pH在5.0～6.5時(shí)，SeO32-和SeO42-提取量無明顯差異，浸提液的pH高于7.0時(shí)，有效硒的提取量下降，表明配置的浸提液pH宜調(diào)節(jié)到6.0左右。

2.10? 測(cè)定方法的驗(yàn)證

添加濃度在 0.01～0.10 mg/kg，準(zhǔn)確度要求允許的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<20%，添加濃度 >0.10 mg/kg時(shí)，允許的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<15%。由表12可知，3個(gè)土壤樣品平均回收率在90.17%～98.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.64%～5.63%，說明測(cè)定方法是正確的。

3? 結(jié)論與討論

土壤硒的有效性是土壤供硒能力、作物吸收能力綜合作用的結(jié)果，在生物強(qiáng)化上必須將作物-土壤-硒結(jié)合考慮[22]。本研究在采用HPLC-AFS法測(cè)定具體土壤樣品有效硒的過程中，發(fā)現(xiàn)存在以下問題。

1）在中國(guó)，大多數(shù)土壤含硒量低于0.4 mg/kg，屬于非富硒土壤，有效硒一般只有10%左右，即0.04 mg/kg以下[20]，在有效硒含量很低的情況下，進(jìn)行形態(tài)分析是沒有意義的。浸提時(shí)，樣品稀釋了10倍，只有2 μg/L，低于方法檢測(cè)限，需要富集后才能采用HPLC-AFS法。

2）土壤樣品本底復(fù)雜，直接上樣嚴(yán)重影響色譜柱壽命。在樣品前處理時(shí)，需要采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行富硒和凈化，C18柱不能吸附SeO42-和SeO32-，陰離子交換柱能吸附SeO42-和SeO32-，但不能吸附有機(jī)硒小分子，且價(jià)格較貴，只能一次性使用，測(cè)試成本高，不便于推廣應(yīng)用。

3）浸提液中SeO42-、SeO32-和有機(jī)硒小分子均為生物有效硒，無需分離測(cè)定。因此，經(jīng)過討論，將方法改為用KH2PO4溶液提取后，浸提液中有機(jī)硒采用HNO3+H2O2消化，SeO42-采用HCL還原后測(cè)定SeO32-的含量。即土壤有效硒的測(cè)定方法為：稱取過60目的土壤樣品1.0 g（精確到0.001 g）于離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 0.25 mol/L KH2PO4浸提液，于30 ℃、1 500 r/min振蕩提取60 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液5 mL于微波消解罐中，加入HNO3 7 mL、H2O2 1 mL，樣品消解完畢后，在趕酸板上趕酸至約2 mL，加入5 mL 6 mol/L鹽酸，再趕酸至2 mL以下，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用5%鹽酸溶液定容，用原子熒光光譜法測(cè)定溶液中硒的含量。

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