作物病原真菌的拮抗菌篩選及其活性物質(zhì)初步鑒定

胡洪濤+張亞妮+張舒+李金泉+張佑宏+汪本福+曹春霞+任淑惠+朱志剛+姚經(jīng)武+龍同+黃大野+楊自文

摘要：從湖北、安徽等地的水稻、小麥、豇豆、西瓜等種植區(qū)采集土壤，進(jìn)行了微生物分離和培養(yǎng)。采用對峙培養(yǎng)法，篩選到20株對11種重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麥赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的細(xì)菌，其中2株具有廣譜抗真菌活性。利用高效液相色譜和質(zhì)譜對其中一株菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了制備和結(jié)構(gòu)初步鑒定，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分為多烯類物質(zhì)，分子量為803.67。繼續(xù)深入研究抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)和抑菌機(jī)理，將有助于新型生物源殺菌劑的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色譜；質(zhì)譜

中圖分類號：S476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）23-0164-04

1 引言

作物真菌性病害，如水稻稻瘟?。≧ice blast）、小麥赤霉?。‵usarium head blight）、西瓜枯萎?。‵usarium wilt of watermelon）、豇豆根腐病（Cowpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年僅因稻瘟病和赤霉病流行導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)數(shù)十億美元^[1，3]，同時，赤霉菌所產(chǎn)生的真菌毒素嚴(yán)重威脅著食品安全^[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土傳性病害，常導(dǎo)致西瓜和豇豆大面積死亡。目前，防治真菌性病害的方法眾多，但多以化學(xué)藥劑防效最好，然而，化學(xué)藥劑大量施用，不僅導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)，也給環(huán)境和食品安全帶來極大隱患。生物農(nóng)藥環(huán)境兼容性好、對生物安全，是作物病害綠色防控技術(shù)體系的關(guān)鍵。供藥篩選的化合物主要由3種獲取途徑，購買已知化合物庫、分離和提取天然產(chǎn)物以及化學(xué)合成，其中微生物來源的天然產(chǎn)物因其種類眾多、易擴(kuò)大和再生，而成為藥物開發(fā)的最主要來源^[5]。由于前人研究多關(guān)注放線菌和真菌，因而在過去所發(fā)現(xiàn)的2萬多種微生物來源的活性物質(zhì)中，絕大部分來源于放線菌和真菌^[5]，只有小部分約7%來源于細(xì)菌，說明細(xì)菌來源的活性物質(zhì)亟待研究和開發(fā)。目前，針對作物真菌病害的生物防治研究，多限于微生物本身，很少涉及到微生物代謝產(chǎn)物，對其活性成分研究更少^[6]。通過在大田采取土樣，進(jìn)行細(xì)菌分離、純化，對具有較好拮抗作用的菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，并提取其代謝產(chǎn)物，利用高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行化合物制備和結(jié)構(gòu)初步鑒定，為開發(fā)新型生物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 供試作物病原真菌

稻瘟菌（Magnaporthe grisea）為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所研究所提供，小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、茄科立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、棉黃萎菌（Verticillium dahliae）、柑橘褐腐（Fusarium spp.）、柑橘黑腐菌（未定種）、柑橘綠霉（Penicillium digitatum）、柑橘青霉（Penicillium italicum）、豇豆根腐菌（Fusarium solani）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxsporum）為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心生物防控研究室分離和保存。

2.2 土壤細(xì)菌分離

用于分離土壤細(xì)菌的土壤，2016年采集于湖北武漢和宜城，及安徽銅陵等地水稻、小麥、豇豆、西瓜等大田，采用稀釋法進(jìn)行土壤細(xì)菌分離。首先，稱取1.0 g 左右土壤，放入裝有玻璃珠的消毒三角瓶，然后，加入100 mL 無菌水，置于搖床（28 ℃，150 r/min）振蕩15 min，采用倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，每個濃度取100 μL，用涂布棒在NA平板上均勻涂布，置于28 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進(jìn)行二次劃線純化，經(jīng)鏡檢無雜菌后，-80 ℃保存于25%甘油管中。

2.3 作物病原真菌拮抗菌初篩

將供試保存的病原真菌在真菌培養(yǎng)基上活化3～5 d，用直徑為5 mm 打孔器沿菌落邊緣打成菌絲塊，將菌絲塊轉(zhuǎn)移至新真菌培養(yǎng)基平板中央，然后，將待測細(xì)菌接種于離菌絲塊15 mm 左右的地方，于26 ℃培養(yǎng)3～5 d后，測量和記錄抑菌圈大小。

2.4 拮抗菌代謝產(chǎn)物提取

拮抗細(xì)菌在NA平板上活化24 h，接種于NA液體培養(yǎng)基的帶擋板的500 mL三角瓶，每瓶培養(yǎng)基體積為50 mL，共接種20瓶，搖床振蕩（28 ℃，150 r/min）培養(yǎng)48 h后，每瓶加入等體積的乙酸乙酯，搖床振蕩（28 ℃，150 r/min）2 h，然后，靜置直至完全分層。將上清小心吸出，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45 ℃，100 Pa）將其蒸干，產(chǎn)物用甲醇溶解后，用于高效液相色譜（HPLC）制備和液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MASS）分析。

2.5 代謝產(chǎn)物HPLC制備

采用高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng)，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）進(jìn)行拮抗菌代謝產(chǎn)物制備。色譜柱為美國SunfireOBD C18 Prep 柱，250×19 mm（i.d），粒徑10 μm；柱溫為室溫；流動相：A為 水，B為乙腈（梯度洗脫）；進(jìn)樣量為3000 μL；流速為27 mL/min； 檢測條件：PDA全波長掃描。

進(jìn)樣體積為1000 μL，柱溫為室溫，流速為24 mL/min，流動相為乙腈和水，采用表1梯度洗脫，乙腈的濃度在 25 min內(nèi)由5%變至100%。每0.5 min收集一個組份，用干凈空氣吹干后進(jìn)行生物活性測定，確定活性成分分布位置（表1）。

2.6 活性物質(zhì)LC-MASS分析

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Micromass Quattro micro質(zhì)譜儀（電噴霧離子源（ESI）），Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。質(zhì)譜檢測條件：電噴霧電離（ESI），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度為 300 ℃，脫溶劑氣體流速500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。endprint