超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定大鼠血清中種神經(jīng)遞質(zhì)

趙芳+李強(qiáng)+梁梅麗+閆艷+邢婕+秦雪梅+高曉霞??

摘要建立了同時(shí)測(cè)定8種神經(jīng)遞質(zhì)（5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA）的超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜方法（UHPLCMS/MS），并用于大鼠血清樣品的測(cè)定。大鼠血清經(jīng)含01% 甲酸乙腈沉淀蛋白處理后，選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×21 mm，17 μm），以01% 甲酸乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫進(jìn)行分離； 采用電噴霧離子源（ESI），在正離子掃描下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)8種神經(jīng)遞質(zhì)及內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，8種神經(jīng)遞質(zhì)可在10 min內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定； 定量限為18 ng/mL，且線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0994，日內(nèi)、日間精密度（n=6）≤92 %，穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)等均符合分析要求。本方法分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、基質(zhì)效應(yīng)小，適用于血清中3類（單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿）共8種神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 神經(jīng)遞質(zhì)； 血清； 含量測(cè)定

1引 言

神經(jīng)遞質(zhì)是在神經(jīng)化學(xué)傳遞中充當(dāng)“信使”的特定化學(xué)物質(zhì)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為4 類，即單胺類、氨基酸類、肽類和其它類[1]。隨著神經(jīng)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的具有神經(jīng)活性的遞質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，且參與人類多種疾病，尤其與精神類疾病，如抑郁癥、焦慮癥、阿爾滋海默病和記憶障礙等密切相關(guān)。神經(jīng)遞質(zhì)種類多，在人體內(nèi)發(fā)揮作用通常并不是由某一類遞質(zhì)含量單獨(dú)變化引起的。但是，神經(jīng)遞質(zhì)在生物樣品中含量低，且生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，內(nèi)源性成分干擾較大，是生物醫(yī)學(xué)分析的難點(diǎn)問(wèn)題。

目前，測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)方法主要有高效液相色譜聯(lián)用紫外、電化學(xué)、熒光或質(zhì)譜檢測(cè)法[2～4]。然而電化學(xué)檢測(cè)因?yàn)殡姌O易受污染而重現(xiàn)性不佳[5]； 紫外檢測(cè)器與熒光檢測(cè)器對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)響應(yīng)信號(hào)弱，均需要柱前或柱后衍生化[6]，處理步驟繁瑣，程度難以控制。因此高效簡(jiǎn)便的前處理方法及高靈敏度的檢測(cè)手段是研究神經(jīng)遞質(zhì)在體內(nèi)濃度變化的關(guān)鍵。質(zhì)譜檢測(cè)因其選擇性強(qiáng)、靈敏度高、樣品前處理步驟簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)成為重要的有效檢測(cè)手段。已有的高效液相色譜質(zhì)譜測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)代謝物多應(yīng)用于腦勻漿或腦微透析液中[7～9]，血清中多側(cè)重于其中某一類神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定，例如只針對(duì)氨基酸類遞質(zhì)的測(cè)定[10]或只針對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的研究[11]。針對(duì)以上情況，本研究在《中國(guó)藥典》（2015年版）生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（9012）的指導(dǎo)下，利用UHPLCMS/MS建立了同時(shí)對(duì)血清中單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿共8種神經(jīng)遞質(zhì)的快速定量方法。本方法前處理簡(jiǎn)單快速，采用內(nèi)標(biāo)法定量，專屬性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好， 適合批量樣本分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器和試劑

1290Ⅱ超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）； 3200 QTRAP 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）； ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 （100 mm×21 mm， 17 μm， 美國(guó)Waters公司）； Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)（力康公司）； MXS可調(diào)式混勻儀（美國(guó)Scilogex公司）。

對(duì)照品： 5羥色胺（5HT，批號(hào)AWEHLMD，日本TCI有限公司）； γ氨基丁酸（GABA，批號(hào)23122，中國(guó)阿拉丁公司）； 谷氨酸（Glu，批號(hào)B326BA1039）和乙酰膽堿（ACH，批號(hào)B326BA2755）均購(gòu)自生工生物公司； 去甲腎上腺素（NE，批號(hào)Z558VXU3，中國(guó)食品藥品檢定研究院）； 多巴胺（DA，批號(hào)S05J6G2）、5羥基吲哚乙酸（5HIAA，批號(hào)ERMPOBK）和高香草酸（HVA，批號(hào)S07J6G1）均購(gòu)自博飛美科公司； 內(nèi)標(biāo)3，4二羥基苯甲酸（DHBA，批號(hào)MKBS7646V，美國(guó)SigmaAldrich公司）。甲醇、乙腈和甲酸（色譜純，Thermo Fisher公司）。 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（MilliQ純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司）。

22實(shí)驗(yàn)方法

221色譜條件流動(dòng)相： 01%甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫程序： 0～25 min，5% B，25～4 min，5%～20% B； 4～7 min，20%～60% B； 7～75 min，60%～5% B； 75～10 min， 5%B。流速： 02 mL/min。柱溫： 30℃。進(jìn)樣量： 3 μL。

222質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）： 正離子模式； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）氣簾氣： 400 psi； 碰撞氣體： N2； 噴霧電壓： 5500 V； 離子源溫度： 500℃； GS1： 50 psi，GS2： 50 psi； 氣體流速： 12 L/min。質(zhì)譜測(cè)定母離子、子離子與儀器參數(shù)見(jiàn)表1。

223標(biāo)準(zhǔn)溶液和QC溶液的配制（1） 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制分別稱取5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA對(duì)照品約50 mg，各加入溶劑（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解，并分別定容至5 mL，制得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。（2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置同一容量瓶中，混勻，加溶劑（02%甲酸甲醇，8∶2， V/V）定容，制得濃度分別為90、45、18、09、045、018和009 μg/mL的5HT和NE，450、225、1125、45、225、90和45 μg/mL的GABA，450、225、1125、45、225、090和045 μg/mL的Glu，24、12、048、024、012、0048和0024 μg/mL的DA， 09、045、018、009、0045、0018、0009 μg/mL的5HIAA、ACH和HVA的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）質(zhì)量控制（QC）液配制同法稀釋配制低、中、高3種不同濃度的溶液，用于配制QC溶液。溶液濃度分別如下： 5HT和NE 72、09和018 μg/mL； GABA 360、45和1125 μg/mL； Glu 36、45和1125 μg/mL； DA 192、024和0048 μg/mL； 5HIAA、ACH和HVA 072、009和0018 μg/mL，4℃保存?zhèn)溆?。endprint

224內(nèi)標(biāo)溶液的制備稱取DHBA對(duì)照品約50 mg，加入溶劑（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解并定容至5 mL，得到濃度約為10 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，加溶劑定容至100 mL，制得濃度為36 μg/mL的DHBA內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

225動(dòng)物分組、血清樣品采集與預(yù)處理SD大鼠24只，隨機(jī)平均分為3組（K，CY，CM），每組8只。其中CY組灌胃給予陽(yáng)性藥鹽酸文拉法辛（35 mg/kg），其它兩組灌胃給予空白溶媒，連續(xù)給藥21天； CY組和CM組自給藥第一天開(kāi)始參照本課題組前期CUMS造模方法連續(xù)造模21天[12]，K組不予造模。在21天實(shí)驗(yàn)完成時(shí)采用腹主動(dòng)脈取血的方式采集血液，置于EP管中，靜置30 min，4℃下3500 r/min離心10 min，分離血清，于

Symbolm@@ 80℃保存?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠血清樣本經(jīng)室溫緩慢解凍。準(zhǔn)確量取大鼠血清100 μL， 置15 mL EP管中， 加入內(nèi)標(biāo)20 μL， 02%甲酸甲醇（8∶2，V/V）溶液20 μL， 01%（V/V）甲酸乙腈200 μL， 渦旋5 min混勻， 4℃下13000 r/min 離心10 min， 取上清液置于進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

3結(jié)果與討論

31神經(jīng)遞質(zhì)的選擇

神經(jīng)遞質(zhì)種類多樣，與人類多種精神類疾病相關(guān)。本研究以抑郁癥動(dòng)物模型為例，測(cè)定了單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿3類神經(jīng)遞質(zhì)，考察得出其含量變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病均有密切關(guān)系。單胺類神經(jīng)遞主要有5HT、NE、DA等，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與許多CNS的生理反應(yīng)。神經(jīng)突觸間隙單胺類遞質(zhì)濃度水平減少被認(rèn)為與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)，抑郁癥自殺患者腦內(nèi)5HT與其代謝物5HIAA含量均有所下降[13]。研究表明，神經(jīng)中樞系統(tǒng)中5HT還與阿爾茲海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切的聯(lián)系[14，15]。神經(jīng)突觸釋放5HT減少是導(dǎo)致CNS發(fā)病的主要因素之一。NE是主要來(lái)自腎上腺髓質(zhì)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其分泌受交感神經(jīng)調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)， 腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)NE含量不足也會(huì)導(dǎo)致抑郁癥，反之則發(fā)生躁狂癥[16]。DA與某些神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙導(dǎo)致的疾病密切相關(guān)，如帕金森病和抑郁癥等[17，18]。Randrup于1975年首先提出，DA含量降低可能與抑郁癥的發(fā)病相關(guān)[19]，且代謝產(chǎn)物HVA含量也會(huì)下降[20]。影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)主要為Glu和GABA。Glu是學(xué)習(xí)和記憶必需的一種興奮性型神經(jīng)遞質(zhì)，但在高濃度下可能產(chǎn)生有害影響。研究表明，慢性應(yīng)激刺激后谷氨酸大量釋放，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)元損害[21]。GABA是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過(guò)抑制性神經(jīng)元突觸前末梢釋放而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。當(dāng)GABA缺乏時(shí)?？烧T發(fā)癲癇發(fā)作，提高GABA的濃度可以起到抗癲癇作用[22]。ACH是多重神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程的重要神經(jīng)遞質(zhì)，人體缺少ACH則會(huì)加速腦細(xì)胞的衰老，使記憶力顯著下降，甚至導(dǎo)致老年癡呆[23]。壓力狀態(tài)下，腦內(nèi)乙酰膽堿能神經(jīng)元功能亢進(jìn)，導(dǎo)致HPA軸功能亢進(jìn)，最終還可以導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[24]。上述8種神經(jīng)遞質(zhì)在人身體各組織系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，其含量變化與人類多種CNS疾病密切相關(guān)[25～27]。因此，檢測(cè)生物樣品中這些物質(zhì)的濃度變化對(duì)于CNS相關(guān)疾病的診斷及治療有重要意義。

32色譜條件優(yōu)化

由于待測(cè)物種類比較多且含酸性堿性等不同類型化合物，因此考察了對(duì)照品溶劑及其不同酸度，分別用189%甲酸甲醇（7∶3， V/V）和02%甲酸甲醇（8∶2， V/V）溶解對(duì)照品并進(jìn)樣，以待測(cè)物的分離度、靈敏度及選擇性為參考基準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)前者有待測(cè)物出現(xiàn)雙峰，而后者待測(cè)物出峰均符合要求。

分別考察了乙腈和甲醇的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動(dòng)相時(shí)出峰更平滑，峰形更好。考慮到待測(cè)物的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相中堿性（氨水）、酸性（01%甲酸、02%甲酸）及緩沖鹽體系（乙酸乙酸銨， pH=35； 10 mmol/L乙酸銨）等添加劑的種類與濃度進(jìn)行考察，綜合比較發(fā)現(xiàn)01%甲酸分析效果最佳。最終確定01%（V/V）甲酸為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B，優(yōu)化后的梯度條件為： 0～25 min， 5% B； 25～40 min， 5%～20% B； 4～7 min， 20%～60% B； 7～75 min， 60%～5% B； 75～10 min， 5%B。 圖1為空白血清和血清中加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)的8種神經(jīng)遞質(zhì)的色譜圖。

33血清樣本預(yù)處理方法的優(yōu)化

本研究中測(cè)定的化合物極性較大，因此重點(diǎn)考察不同溶劑沉淀蛋白的效果。對(duì)沉淀蛋白的有機(jī)試劑甲醇和乙腈進(jìn)行考察，結(jié)果顯示經(jīng)乙腈沉淀蛋白后待測(cè)物的峰形更平滑，背景基質(zhì)干擾更小。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在乙腈中加入甲酸可以改善目標(biāo)化合物的峰形，且01%甲酸乙腈（V/V）為最佳。推測(cè)可能由于待測(cè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均含酸性或堿性基團(tuán)的原因。

34方法學(xué)考察

由于待測(cè)化合物屬于大鼠血清樣本中內(nèi)源性物質(zhì)，為了降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本研究依據(jù)《中國(guó)藥典2015年版生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（9012）》，采用血清基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察了標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、提取回收與基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

341標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取離心機(jī)管數(shù)支，分別加入已知濃度的大鼠血清100 μL、20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液（36 μg/mL）和20 μL的標(biāo)準(zhǔn)系列液，渦旋混勻。按照“血清樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作。以待測(cè)物峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（Ai）的比值與空白血清樣品中待測(cè)物峰面積（A0）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（A0i）比值的差值為縱坐標(biāo)（y=As/Ai–A0/A0i）、以血清中加入的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，權(quán)重系數(shù)為 1/x2，得到8種神經(jīng)遞質(zhì)的回歸曲線方程。 LOQ是標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)，信噪比（S/N）>10。結(jié)果見(jiàn)表2。endprint

342準(zhǔn)確度和精密度取空白血清100 μL，分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液和20 μL高、中、低3個(gè)濃度的QC溶液，配制成高、中、低3個(gè)濃度水平的樣品，按照225方法進(jìn)行預(yù)處理。每個(gè)濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，并且連續(xù)進(jìn)樣3天，根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算高、中、低3個(gè)濃度水平樣品的濃度，求算本方法的精密度RSD（%）和準(zhǔn)確度RE（%），結(jié)果見(jiàn)表3。

343基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率取空白血清100 μL，分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)和20 μL高、中、低3個(gè)濃度的QC溶液，按照225節(jié)預(yù)處理，測(cè)得的待測(cè)物峰面積為A1； 另取空白大鼠血清100 μL，先按照225節(jié)預(yù)處理，加入20 μL內(nèi)標(biāo)和20 μL高、中、低3個(gè)濃度的QC溶液，混勻測(cè)得的待測(cè)物峰面積為A2； 取空白溶劑100 μL，分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)和20 μL高、中、低3個(gè)濃度的QC溶液，按照225節(jié)預(yù)處理，測(cè)得的待測(cè)物峰面積為A3，每個(gè)濃度樣品分別平行制備3份。提取回收率= A1/A2×100%； 基質(zhì)效應(yīng)= A2/A3×100%。結(jié)果見(jiàn)表3。

35樣品分析

采用本方法對(duì)SD大鼠血清進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示，與空白對(duì)照組相比，模型組5HT和NE含量顯著降低，GABA和5HIAA的含量顯著升高，與文獻(xiàn)[11，28～30]報(bào)道的研究結(jié)果一致。Glu、DA、Ach和HVA雖也具有升高趨勢(shì)（3%～10%），但未顯示顯著差異。經(jīng)文拉法辛給藥后，5HT、GABA和5HIAA顯著回調(diào)； NE和Glu有回調(diào)趨勢(shì)，與文拉法辛的抗5HT與NE的再攝取抑制作用機(jī)制一致。

4結(jié) 論

本研究建立了同時(shí)對(duì)大鼠血清中單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿共8種神經(jīng)遞質(zhì)的UPLCMS/MS快速定量分析方法，優(yōu)化了血清樣品制備方法，減少了前處理步驟繁瑣帶來(lái)的較多誤差，分析更加快速簡(jiǎn)便。 本方法線性關(guān)系較好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)均符合相關(guān)要求。本方法不僅可用于抑郁癥血清樣品中神經(jīng)遞質(zhì)水平的測(cè)定，而且可用于CNS相關(guān)疾病樣品的測(cè)定與診斷。

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AbstractAn ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （LCMS/MS） method for simultaneous determination of 8 kinds of neurotransmitters （5HT， GABA， Glu， ACH， NE， DA， 5HIAA， HVA） in rat serum was developed The blood samples were extracted by 01% formic acid in acetonitrile and separated on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （21 mm×100 mm， 17 μm） using gradient elution， with the mobile phase consisting of acetonitrile and 01% formic acid in water The samples were then ionized with positive electrospray （ESI+）， and detected under multiple reaction monitoring （MRM） mode As a result， 8 kinds of neurotransmitters were determined accurately in 10 min with a limit of quantitation of 18 ng/mL and intraday and interday precisions of ≤92% （n=6） This method showed a good linearity in detection of neurotransmitters and the linear correlation coefficients were greater than 0994 Also the stability， recovery and matrix effect were eligible for the analysis This method showed high accuracy， sensitivity， strong specificity， good stability， small matrix effect and short time for analysis， and was suitable for the quantitative determination of monoamine， amino acids and acetylcholine neurotransmittes in rat serum

KeywordsUltrahigh performance liquid chromatographtandem mass spectrometry； Neurotransmitters； Serum； Determinationendprint