雙功能單體法制備磁性奧硝唑分子印跡聚合物及應用

廖素蘭 陳少云+劉奇琳+陳良壁+李曉敏

摘要采用懸浮聚合法，以奧硝唑（ONZ）為模板分子、 甲基丙烯酸（MAA）和丙烯酰胺（AA）為雙功能單體、 二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）為交聯劑，利用Fe3O4磁性納米粒子制備了奧硝唑磁性分子印跡聚合物（MMIPs）。通過掃描電子顯微鏡（SEM）、 紅外光譜（FTIR）、 磁化強度分析（VSM）、 紫外可見吸收光譜 （UVVis）及熱重分析（TGA）等對合成的聚合物進行了表征。結果表明，雙功能單體MMIPs對奧硝唑的吸附量高于相應的單功能單體MMIPs； 對類似物質也有一定的吸附能力。利用等溫吸附數據進行 Scatchard 分析，從而推斷出MMIPs對于模板分子的作用存在兩種不同的結合位點，最大吸附量Qmax1為4896 μmol/g，Qmax2為1060 μmol/g。結合高效液相色譜分析技術，將所制備的MMIPs應用于河水樣品中硝基咪唑類抗生素的提取富集，加標回收率為854%～1043%，方法簡便易行、 準確可靠。

關鍵詞雙功能單體； 磁性分子印跡； 硝基咪唑類藥物； 高效液相色譜； 固相萃取

1引 言

硝基咪唑（Nitroimidazoles）是一類含有5硝基咪唑環(huán)結構的化合物，主要有甲硝唑（Mertonidazole，MNZ）、 二甲硝咪唑（Dimetridazole，DMZ）、 羅硝唑（Ronidazole，RNZ）、 奧硝唑（Ornidazole，ONZ）和塞克硝唑（Secnidoazel，SNZ）等， 曾廣泛用于醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖業(yè)。然而其濫用已對食品安全及環(huán)境構成威脅，許多國家及地區(qū)已禁止該類藥物用于食源性食物，我國也于 2002 年禁止該藥物的使用[1]。但是仍有非法使用的事件發(fā)生，且由于硝基咪唑類藥物難以被生物降解，在各種水體中已被檢測到 [2]，其殘留分析也成為當前關注的熱點之一[3～14]。實際樣品中硝基咪唑的含量一般較低，且基質成分復雜，通常在檢測之前需對實際樣品進行預富集。常用的預富集方法為固相萃取法，具有操作簡便、 快速、 溶劑使用量少等特點，但選擇性差[3～7]。分子印跡聚合物（MIPs）模擬抗原和抗體的識別，擁有在形狀、 尺寸和官能團與模板分子相匹配的分子識別空穴。基于分子印跡技術的分子印跡聚合物對特定的分析物或一組結構相關的化合物具有高的選擇性和親合性[12，13]。磁性分子印跡聚合物（MMIPs）兼具磁響應性材料和分子印跡聚合物的優(yōu)點，在外加磁場的條件下，可以直接選擇性分離富集分析物，分離更加簡單有效，無需額外的離心或過濾，在痕量污染物萃取分離領域展現了非常優(yōu)越的性能，已逐漸成為樣品前處理中最具有應用前景的研究方向之一[9]。

傳統(tǒng)的基于甲基丙烯酸（MAA）分子印跡聚合物的制備，通常采用MAA為單功能單體。然而，采用雙功能單體，已被證實可以提高分子印跡聚合物的模板識別能力[14，15]，饒維等[15]以β環(huán)糊精和4乙烯基吡啶為雙功能單體，成功合成了對雙酚A具有特異吸附性能的磁性印跡復合材料。磁性分子印跡聚合物的合成方法有懸浮聚合法、 乳液聚合法、 基于硅膠表面修飾的磁性分子印跡方法等[16～18]?；诠枘z表面修飾的磁性分子印跡方法，制作過程費時繁瑣[9]； 乳液聚合法包覆的磁性粒子易泄漏[17]； 懸浮聚合法具有方法簡單、 吸附力強等優(yōu)點[17]?；诖耍狙芯恳约谆┧幔∕AA）和丙烯酰胺（AA）為雙功能單體、 二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）為交聯劑，采用懸浮聚合法制備了新型磁性奧硝唑（ONZ）分子印跡聚合物，考察了其對奧硝唑及類似物的吸附性能，將制備的MMIPs用于環(huán)境樣品中硝基咪唑類抗生素多殘留的選擇性識別與分離，效果良好。相比于現有的方法，本方法簡便易行、 可批量化進行前處理，成本低，結果準確可靠。此磁性印跡固相萃取技術為環(huán)境水樣中痕量硝基咪唑類抗生素殘留的分離富集及檢測提供了有效的新方法。

2實驗部分

21儀器與材料

UV3200紫外可見分光光度計（上海美譜達有限公司）； VEGA3 SBH掃描電子顯微鏡（捷克 TESCAN公司）； SDTQ600同步熱分析儀（美國TA公司）； AVATAR330傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）； 1260 型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司），配Agilent C18柱（250 mm × 46 mm， 5 μm）； 7410樣品振動磁強計（美國LakeShore公司）。

ONZ （990%）、 ONZ、 MNZ、 SNZ標準品（大連美侖生物技術有限公司）； DMZ、 RN標準品Z（百靈威科技有限公司）； MAA（東京化成工業(yè)株式會社）； AA、 EDMA、 FeCl2·4H2O （阿拉丁公司）； FeCl3·6H2O、 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和偶氮二異丁腈（AIBN）（美國Sigma公司）； 油酸（DC，85%，上海晶化試劑有限公司）； 甲醇（色譜純）； 其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。河水水樣收集于武夷山自來水水源地。

22實驗方法

221奧硝唑磁性分子印跡聚合物的制備參考文獻[19]方法合成Fe3O4納米顆粒。稱取Fe3O4納米顆粒25 g，加入油酸25 mL，勻速振蕩得到油酸修飾的Fe3O4納米顆粒。將10 mmol ONZ、 20 mmol MAA和20 mmoL AA溶于125 mL甲醇和125 mL丙酮的混合液，加入16 mmoL EDMA、 025 g AIBN及油酸修飾的Fe3O4納米顆粒，混勻，轉入含01 g PVP的25 mL甲醇和丙酮混合液與1 mL水的混合溶液中。攪拌下通N2，60℃聚合24 h。分別用甲醇冰乙酸（9∶1，V/V）、 甲醇及水充分洗去印跡分子及未聚合的單體，真空干燥。同法制備MNIPs，只是不加模板分子。MMIP1、 MMIP2、 MMIP3和相應的MNIPs，按表1所列的組成，以同樣的方法合成。endprint

222吸附實驗動態(tài)吸附實驗： 將10 mg MMIPs或MNIPs分散在5 mL 004 mmol/L ONZ乙醇溶液，在25℃恒溫振蕩，在一定時間間隔 （10、 20、 30、 40、 50、 60、 90、 120、 150和180 min）內磁性分離，檢測上清液中ONZ含量。

硝基咪唑類藥物吸附實驗： 在每支含10 mg MMIPs或MNIPs試管中分別加入5 mL濃度為001、 0015、 002、 0025、 003、 0035、 004、 0045和005 mmol/L ONZ （MNZ或SNZ）的乙醇溶液，在25℃下恒溫振蕩24 h后，磁性分離，檢測上清液中硝基咪唑藥物含量。

根據下式計算吸附容量Q （μmol/g）：

Q=[V× （C0-CS）] ×103/m

式中，C0（mmol/L）和CS（mmol/L）分別為測試溶液的初始濃度和平衡濃度，V （L）為溶液體積，m （g）為吸附材料的用量。取3次測定平均值進行計算。

223色譜條件流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液（pH 30），流動相B為甲醇。梯度洗脫程序： 0～5 min，76%～76% A； 5～6 min，76%～65% A； 6～8 min，65%～53% A； 8～9 min，53%～76% A。檢測波長315 nm，流速10 mL/min，柱溫39℃，進樣量5 μL。

224磁性固相萃取水樣經045 μm濾膜過濾，調節(jié)至pH 60，將500 mL水樣與120 mg經甲醇活化及去離子水清洗的MMIPs混合，振蕩富集10 h后磁場分離； 收集的MMIPs加入30 mL 80%甲醇溶液（pH 20）洗脫，收集洗脫液，于40℃下N2吹干，用10 mL甲醇溶解，045 μm濾膜過濾，用于HPLC 測定。

3結果與討論

31功能單體的選擇

如表1所示，MMIP1、 MMIP2、 MMIP3和相應的MNIPs表現出不同的吸附能力，MMIPs對ONZ的吸附量均大于相應的MNIPs吸附量，MMIPs吸附能力順序為MMIP1>MMIP3>MMIP2，可能是由于酸性MAA的羥基易與硝基咪唑環(huán)上氮形成氫鍵，堿性AA的酰氨基易與硝基咪唑上羥基等形成氫鍵，功能單體優(yōu)勢互補，有助于提高聚合物對模板分子的吸附性，因此，雙功能單體印跡聚合物比單一功能單體對模板分子表現出更好的吸附能力。

32MMIPs的結構表征

321奧硝唑磁性印跡聚合物的形態(tài)、 粒徑及組成制備的MMIPs與MNIPs形貌相似，MMIPs由許多大小均勻的微球組成（圖1A， 圖1B），分子印跡聚合物包覆在黑色磁性粒子表面（圖1C， 圖1D）。MMIPs表現出明顯的超順磁性，無剩磁、 磁滯和矯頑磁力（圖2A）。在外界磁場下，MMIPs可以迅速地與溶液分離，滿足磁性分離的要求（圖2A插圖）。紅外光譜（圖2B）中，581和584 cm

322熱重分析（TGA）由圖3可見，在0℃～302℃內，MMIPs的熱穩(wěn)定較好，不易產生分解，對應的失重率為129%，主要是游離水的失重； 302℃～650℃時，MMIPs出現較大的失重，失重率為821%，是由于包裹磁顆粒的聚合層分解。上述結果與文獻[22]的結論基本一致。

33MMIPs的吸附性能

331動態(tài)吸附由圖4可見，ONZ濃度為004 mmol/L時，在0～60 min內，MMIPs和MNIPs對ONZ的吸附量都隨著時間的延長而不斷變大，MMIPs的吸附量在60 min時達670 μmol/g，因為吸附劑表面大部分為空的結合位點，模板分子與吸附劑易于結合； 60 min后，吸附量基本不變，達到吸附平衡。在動態(tài)吸附過程中，分子印跡聚合物的吸附量明顯高于非分子印跡聚合物。

332聚合物對硝基咪唑類藥物的吸附性能測定了磁性分子印跡聚合物對001～005 mmol/L濃度范圍的ONZ及其結構類似物MNZ和SNZ的靜態(tài)吸附性能。由圖5可見，隨著初始濃度增大，分子印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附量呈上升趨勢。相同初始濃度下，MMIPs對3種物質吸附量的順序為： QONZ>QSNZ>QMNZ，與物質和模板的相似程度一致，MMIPs對模板分子及類似物的吸附量明顯大于相應MNIPs，這是由于MMIPs經洗脫留下了與模板功能基以及空間結構大小相匹配的空穴，賦予了MMIPs對模板及類似物的特異識別性能。

34Scatchard分析

采用Scatchard模型對MMIPs的吸附性能作進一步分析，公式如下：

Q/C=（Qmax-Q）/Kd

其中，Qmax（μmol/g）為MMIPs的最大表觀吸附量，Kd（μmol/L）為MMIPs的平衡離解常數，Q （μmol/g）為MMIPs在每個濃度下的平衡吸附量。

由圖6可見線性關系良好的兩條直線，說明MMIPs對于模板分子的作用力是兩種不同的方式，存在兩種不同的結合位點。兩段直線的線性回歸方程分別為： Y1=

Symbolm@@ 4896X1+38656，Kd=38656 μmol/L，Qmax=4896 μmol/g； Y2=

Symbolm@@ 1060X2+24909，Kd=24909 μmol/L， Qmax=1060 μmol/g。

35方法的分析性能

在優(yōu)化的條件下，分別對MNZ、 RNZ、 DMZ、 SNZ和ONZ系列混合標準物水溶液進行萃取和HPLC分析，各物質的線性范圍、 線性相關系數、 檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）見表2。

36實際樣品分析

將本方法用于河水樣品中硝基咪唑樣品的測定，由圖7可見， 樣品經MMIPs萃取后， 可有效去除基質干擾。從表3可見，兩個水平的加標回收率為854%～1043%，相對標準偏差為12%～75%，表明制備的MMIPs能夠有效分離富集環(huán)境水樣中的硝基咪唑類抗生素。endprint

References

1Ministry of Agriculture No 193， Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China 20140806

農業(yè)部中華人民共和國農業(yè)部公告第193 號 20140806

2REN Xiaodong， XIONG ZhenHu Acta Chimica Sinica， 2013， 71： 625-633

任曉東， 熊振湖 化學學報， 2013， 71： 625-633

3 Cronly M， Behan P， Foley B， Malone E， Regan L J Chromatogr A， 2009， 1216： 8101-8109

4Tlgyesi ， Sharma V K， Fekete S， Fekete J， Simon A， Farkas S J Pharm Biomed Anal， 2012， 6465： 40-48

5ZHANG Yi， YUE ZhenFeng， LAN Fang， ZHAO FengJuan， XIAO ChenGui， OUYANG Shan， WU WeiDong， WU YongNing， LI LiSu Chinese J Anal Chem， 2012， 40（5）： 724-729

張 毅， 岳振峰， 藍 芳， 趙鳳娟， 肖陳貴， 歐陽姍， 吳衛(wèi)東， 吳永寧， 李麗蘇 分析化學， 2012， 40（5）： 724-729

6CAO Hui， CHEN XiaoZhen， ZHU Yan， LI ZuGuang Chem J Chin Univ， 2013， 34（12）： 2710-2715

曹 慧， 陳小珍， 朱 巖， 李祖光 高學?；瘜W學報， 2013， 34（12）： 2710-2715

7HernándezMesa M， Lara F J， CrucesBlanco C， GarcíaCampaa Talanta， 2015， 144： 542-550

8Chen D， Deng J， Liang J， Xie J， Hu C H， Huang K H Sens Actuators B， 2013， 183： 594-600

9Hu C H， Deng J， Zhao Y B， Xia L S， Huang K H， Ju S Q， Xiao N Food Chem， 2014， 158： 366-373

10ZHANG Lu， KONG XiangHong， WANG Han Chinese J Anal Chem， 2014， 42（12）： 1735-1742

張 璐， 孔祥虹， 王 菡 分析化學， 2014， 42（12）： 1735-1742

11Wang Y Y， Li X W， Zhang Z W， Ding S Y， Jiang H Y， Li J C， Shen J Z， Xia X Food Chem， 2016， 192： 280-287

12Liu J， Zhang L， Han Song L L， Liu Y， Tang H， Li Y C J Sep Sci， 2015， 38： 1172-1178

13Zelníkov H， Rejtharov M Food Addit Contam A， 2013， 30（6）： 1123-1127

14Liao S L， Wang X C， Lin X C， Xie Z H Electrophoresis， 2010， 31（16）： 2822-2830

15RAO Wei， YIN YuLi， LONG Fang， ZHANG ChaoHui Chem J Chinese Univ， 2015， 36（3）： 449-455

饒 維， 尹玉立， 龍 芳， 張朝暉 高等學?；瘜W學報， 2015， 36（3）： 449-455

16ZHAO LiJuan， QI YuXia， WEI ChanLing， LI WenJing， LI Ya， WANG FuQiang， GONG BoLin Chinese J Anal Chem， 2016， 44（10）： 1562-1567

趙麗娟， 祁玉霞， 魏纏玲， 李文婧， 李 亞， 王富強， 龔波林 分析化學， 2016， 44（10）： 1562-1567

17DENG Fang， LI YueXiang， LUO XuBiao， DONG RuiZhi， TU XinMan， Wang Mei Polym Mater Sci Eng， 2011， 27（4）：171-174

鄧 芳， 李越湘， 羅旭彪， 董睿智， 涂新滿， 王 玫 高分子材料科學與工程， 2011， 27（4）：171-174

18HUANG ChaoNan， DUAN XiJian， MA HaiPeng， YU YanHan， CHEN LiGang Journal of Instrumental Analysis， 2013， 32（3）： 275-280

黃超囡， 段西健， 麻海鵬， 于嫣涵， 陳立鋼 分析測試學報， 2013， 32（3）： 275-280

19DING Lan， CHEN LiGang， ZHANG XiaoPan， XU Yang， JIN HaiYan China Patent， 2009100669630， 2009endprint

丁 蘭， 陳立鋼， 張曉盼， 徐 陽， 金海燕 中國專利， 2009100669630， 2009

20WEI ShouLian， LIU Ling， LI JingHua， WANG HongWu， LIU Yong Chinese J Anal Chem， 2015， 43（1）： 105-109

韋壽蓮， 劉 玲， 黎京華， 汪洪武， 劉 永 分析化學， 2015， 43（1）： 105-109

21Song X L， Li J H， Wang J T， Chen L X Talanta， 2009， 80： 694-702

22MAO YanLi， NIU YunFeng， WU JunFeng， KANG HaiYan， LI Dong， WANG XiangWen Chinese J Anal Chem， 2016， 44（6）： 915-922

毛艷麗， 牛云峰， 吳俊峰， 康海彥， 李 東， 王巷文 分析化學， 2016， 44（6）： 915-922

AbstractThe magnetic molecularly imprinted polymers （MMIPs） was synthesized by suspension polymers technique using ornidazole （ONZ） as template， and methacrylic acid （MAA） and acrylamide （AA） as the binary functional monomers The MMIPs were characterized by means of scanning electron microscopy （SEM）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， vibrating sample magnetometer （VSM）， thermogravimetric analysis （TGA） and ultravioletvisible （UVVis） spectrophotometer The results indicated that the adsorption capacity of MMIPs using the binary functional monomers to ONZ was higher than that using single functional monomer or that of its structural analogues The Scatchard plot revealed that the template polymer system had a twosite binding behavior and the MMIPs exhibited the maximum rebinding to ONZ at 4896 μmol/g and 1060 μmol/g Combined with high performance liquid chromatographic analysis technology， the prepared MMIPs were successfully applied to extract and enrich trace nitroimidazoles from river water samples with recoveries range of 854%-1043% The precision of the results was good， and the manipulation of the developed method was simple and fast comparing to other methods

KeywordsDual functional Monomers； Magnetic molecularly imprinted； Nitroimidazoles； High performance liquid chromatography； Solid phase extractionendprint