激酶檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展

劉楊+鄒笑然+李琛琛+張春陽(yáng)

摘要激酶是生物體內(nèi)一類(lèi)重要的磷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠催化磷酸基團(tuán)由高能磷酸基團(tuán)供體分子（如AP）向特定底物分子轉(zhuǎn)移。激酶不但在新陳代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)調(diào)控、細(xì)胞傳輸?shù)冗^(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而且在臨床診斷、藥物研發(fā)及疾病靶向治療等方面也發(fā)揮著重要作用。因此，發(fā)展靈敏度高、特異性好的激酶檢測(cè)方法十分必要。本文以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2， CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）為例，對(duì)近年來(lái)發(fā)展的激酶檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，著重介紹了熒光分析法、單分子檢測(cè)、比色法、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分析法、電化學(xué)和光電化學(xué)分析法，并對(duì)激酶檢測(cè)方法的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞激酶； 靈敏檢測(cè)； 分析方法； 評(píng)述

1引 言

激酶（Kinase）是生物體內(nèi)一類(lèi)催化磷酸基團(tuán)由高能磷酸基團(tuán)供體分子（如AP）向特定底物分子轉(zhuǎn)移的酶，其催化的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移過(guò)程亦稱(chēng)磷酸化。激酶的作用底物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核苷酸等。根據(jù)作用底物的不同，可分為蛋白激酶、脂質(zhì)激酶、碳水化合物激酶等。激酶廣泛參與新陳代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)調(diào)控、細(xì)胞傳輸?shù)戎匾?xì)胞過(guò)程，對(duì)維持生物體正常的生理功能十分重要。激酶的突變將導(dǎo)致激酶功能紊亂，激酶功能的失調(diào)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。由于激酶在細(xì)胞中起著信號(hào)調(diào)節(jié)作用，激酶亦是重要的藥物靶標(biāo)[3]。

在種類(lèi)眾多的激酶中，蛋白激酶（Protein kinase）是最大的一類(lèi)激酶族群。人類(lèi)基因組中存在518種蛋白激酶基因， 約占其總量的2%[，5]。蛋白激酶能夠?qū)⒘姿峄鶊F(tuán)從核苷三磷酸（通常是腺苷5'三磷酸，AP）轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的氨基酸殘基上，催化蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)。根據(jù)其底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類(lèi)不同，蛋白激酶可分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、組氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、天冬氨?；?谷氨?；鞍准っ肝孱?lèi)。蛋白激酶通過(guò)調(diào)節(jié)底物蛋白的活性、相互作用[6，7]及穩(wěn)定構(gòu)象，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞功能（如細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞凋亡、代謝和蛋白合成）[8]，并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]、免疫應(yīng)答[10]、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[11]和能量平衡[12]等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。蛋白激酶的突變和活性的失調(diào)可導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，如癌癥[11]、糖尿病并發(fā)癥[13]、神經(jīng)病癥和神經(jīng)變性疾病[1]以及心臟功能障礙[15]等。蛋白激酶已成為疾病的藥物治療靶標(biāo)[16，17]，美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（DA）已批準(zhǔn)多種蛋白激酶抑制劑用于癌癥治療[18]。

多核苷酸激酶（Polynucleotide kinase，PNK）也是一種具有重要生理功能的激酶，廣泛存在于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中。PNK同時(shí)具有5'激酶和3'磷酸酶活性，可以催化DNA或RNA分子末端，將5'O/3'PO轉(zhuǎn)化成5'PO/3'O[19]。通過(guò)催化5'羥基末端的磷酸化，PNK在許多細(xì)胞活動(dòng)（如DNA重組[20]和DNA/RNA修復(fù)[21]）中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，PNK的突變能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如小頭癥和癲癇[22]、Werner綜合征、Bloom綜合征和Rothmundhomson綜合征等[23]。

激酶廣泛參與生物體內(nèi)多種細(xì)胞過(guò)程，在復(fù)雜的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。因而發(fā)展靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、成本低的激酶活性檢測(cè)方法，在激酶功能研究、臨床診斷、藥物篩選以及疾病靶向治療等方面都具有重要意義。激酶活性檢測(cè)的常規(guī)方法包括放射性同位素標(biāo)記法、放射自顯影像法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法[19，2～26]。但是這些方法存在放射性污染、檢測(cè)耗時(shí)、操作繁瑣、不適用于大規(guī)模篩選等缺點(diǎn)。因此，迫切需要發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、超靈敏且環(huán)境友好的激酶檢測(cè)方法。近年來(lái)，非放射性檢測(cè)方法如熒光分析法、比色法、電化學(xué)分析法、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分析法等蓬勃發(fā)展，在激酶檢測(cè)研究中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[27]。本文主要以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2，CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）為例，結(jié)合本課題組的工作，綜述近年激酶活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。PKA又稱(chēng)為依賴(lài)于cAMP的蛋白激酶A （CyclicAMP dependent protein kinase A），是目前研究最廣泛的蛋白激酶，常作為激酶活性檢測(cè)的模型[28，29]； CKII是一種普遍參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等重要生理過(guò)程[30]的蛋白激酶，其異常表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)； PNK是一種由噬菌體的pse基因編碼的激酶，常作為多聚核苷酸激酶的模型被廣泛研究，同時(shí)也是核酸探針標(biāo)記和基因工程中重要的工具酶[31，32]。

2激酶的檢測(cè)方法

21熒光分析法

與傳統(tǒng)的分析方法相比，熒光分析法具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、適用于高通量分析等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，熒光分析法與新型納米材料、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于激酶檢測(cè)的研究。石墨烯氧化物（GO）是一種單分子層厚度的二維（2D）碳納米材料，能有效猝滅熒光基團(tuán)的發(fā)光。GO具有可控的表面吸附性質(zhì)，是構(gòu)造生物傳感器的最佳選擇[33]。Lin等[3]將GO和λ核酸外切酶相結(jié)合，對(duì)多核苷酸激酶（ PNK）的活性和抑制作用進(jìn)行分析，檢出限為005 U/mL。該方法無(wú)需復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)，具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。Sun等[35]將GO與核酸外切酶III（Exo III）和連接酶介導(dǎo)的循環(huán)反應(yīng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的猝滅和放大，將 PNK的檢出限降低至0003 U/mL。該方法無(wú)需設(shè)計(jì)特定的酶識(shí)別序列，靈敏度高。hou等[36]構(gòu)造了一種新型GO肽納米傳感器，可定量檢測(cè)蛋白激酶。發(fā)生磷酸化的肽鏈會(huì)抑制羧肽酶Y（CPY）的降解，導(dǎo)致染料標(biāo)記的肽鏈吸附到GO表面，熒光信號(hào)被猝滅； 而未發(fā)生磷酸化的肽鏈被CPY降解，熒光信號(hào)不受GO影響。該方法已成功應(yīng)用于檢測(cè)CKII和PKA，檢出限分別為00833和0130 mU/μL。該方法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)進(jìn)行熒光各向異性分析。endprint

除石墨烯氧化物外，一系列新型納米材料也廣泛應(yīng)用于構(gòu)建激酶的熒光分析體系。Li等[37]設(shè)計(jì)了一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針修飾的多功能磁性納米微球，結(jié)合聚合切口反應(yīng)介導(dǎo)的超支化滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），對(duì) PNK活性進(jìn)行靈敏檢測(cè)，檢出限可達(dá)0036 mU/mL。 該方法可用于定量分析細(xì)胞提取物中 PNK活性。Qing等[38]利用啞鈴狀DNA模板合成銅納米粒子，應(yīng)用于 PNK和連接酶活性的檢測(cè)。該方法無(wú)需熒光標(biāo)記，對(duì) PNK檢出限為005 U/mL。 Cen等[39]利用羥基氧化物CoOO納米片作為探針，結(jié)合λ核酸外切酶裂解反應(yīng)檢測(cè) PNK活性，檢出限可達(dá)001 U/mL。Liu等[0]利用稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米粉（UCNPs）構(gòu)建了發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移（LRE）體系，用于蛋白激酶PKA分析（圖1）。在該體系中，稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米粉NaY：Yb，Er作為L(zhǎng)RE供體以及磷酸化肽鏈的識(shí)別基質(zhì)，四甲基羅丹明（AMRA）標(biāo)記的底物肽鏈作為L(zhǎng)RE受體。染料標(biāo)記的底物肽鏈被PKA磷酸化后，能被UCNPs中的稀土離子特異性捕獲，實(shí)現(xiàn)AMRA與UCNPs之間的LRE過(guò)程，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法無(wú)需添加額外的識(shí)別分子，操作步驟簡(jiǎn)單。由于UCNPs允許多個(gè)低頻光子的激發(fā)，因而能夠避免自發(fā)熒光和光散射等背景干擾，信噪比好，靈敏度高，檢出限可達(dá)5×10Symbolm@@ 5 U/μL。

基于主客體相互作用對(duì)熒光染料分子的保護(hù)，環(huán)糊精及其聚合物能顯著增強(qiáng)熒光分子的發(fā)光效應(yīng)[1]，可用于構(gòu)建激酶的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。Song等[2]發(fā)展了基于β環(huán)糊精聚合物（polyβCD）和λ核酸外切酶反應(yīng)的 PNK活性分析方法。polyβCD能使染料分子的熒光信號(hào)增強(qiáng)10倍以上，顯著提高激酶檢測(cè)的靈敏度，檢出限可達(dá)002 U/mL。該方法避免了DNA探針的雙標(biāo)記和復(fù)雜設(shè)計(jì)，可用于復(fù)雜樣品分析。Xu等[3]利用芘作為熒光探針，利用γ環(huán)糊精結(jié)合DNA托鏈位移反應(yīng)（SDR）實(shí)現(xiàn)兩次熒光信號(hào)放大，顯著提高 PNK檢測(cè)的靈敏度，檢出限達(dá)93×10Symbolm@@ 5 U/mL。

最近，hang等[]開(kāi)發(fā)了一種λ核酸外切酶輔助的紙基熒光分析法，可用于PNK活性的檢測(cè)。該方法通過(guò)分析醛基改性紙張表面Cy5熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)PNK活性，檢出限為00001 U/mL。Cheng 等[5]將DNA鏈置換反應(yīng)與酶輔助擴(kuò)增相結(jié)合，用于檢測(cè) PNK活性。該方法無(wú)需進(jìn)行熒光標(biāo)記，靈敏度高，檢出限可達(dá)66×10Symbolm@@ U/mL。hang等[6]發(fā)展了一種流式細(xì)胞術(shù)磁珠測(cè)定法（CBA），用于超靈敏檢測(cè) PNK活性。該方法利用雜交鏈反應(yīng)（CR）擴(kuò)增技術(shù)對(duì)磁珠表面的熒光信號(hào)進(jìn)行放大，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)讀取磁珠表面的熒光信號(hào)，檢出限可達(dá)×10Symbolm@@ 6 U/mL。該方法靈敏度高，特異性好，適用于復(fù)雜生物基質(zhì)的檢測(cè)。

22單分子檢測(cè)

單分子檢測(cè)技術(shù)能夠在單分子水平上對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行超靈敏檢測(cè)，具有靈敏度高、信噪比好、檢測(cè)樣本需求量少等優(yōu)點(diǎn)，在生化分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Wang等[7]構(gòu)建了基于單個(gè)量子點(diǎn)（QD）的納米傳感器，可對(duì)蛋白激酶PKA進(jìn)行超靈敏檢測(cè)（圖2）。當(dāng)PKA和磷?；wγ生物素AP存在時(shí)，Cy5標(biāo)記的底物肽鏈可同時(shí)實(shí)現(xiàn)磷酸化和生物素化，并自組裝到修飾有鏈霉親和素的QD表面，形成Cy5肽QD夾心納米結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)QD和Cy5之間的RE。通過(guò)全內(nèi)反射熒光（IR）顯微鏡可對(duì)RE信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量，用于PKA定量分析。該方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需洗滌和分離步驟，靈敏度高，檢出限為93×10Symbolm@@ 6 U/μL。該方法還可用于篩選PKA抑制劑和激活劑。

本課題組[8]利用金納米粒子（AuNP）對(duì)熒光信號(hào)的猝滅及磷酸化誘導(dǎo)的熒光信號(hào)恢復(fù)，結(jié)合λ核酸外切酶介導(dǎo)的裂解反應(yīng)，在單分子水平上對(duì)PNK進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。當(dāng) PNK存在時(shí)，發(fā)夾探5'羥基末端磷酸化，隨后在λ核酸外切酶作用下，發(fā)夾探針展開(kāi)并暴露結(jié)合探針序列。結(jié)合探針與Cy5捕獲探針AuNP納米復(fù)合體中的捕獲探針雜交，形成雙鏈DNA（dsDNA）。該dsDNA能被λ核酸外切酶裂解，釋放出Cy5分子和結(jié)合探針。釋放的結(jié)合探針能與新的Cy5捕獲探針AuNP納米復(fù)合體中的捕獲探針雜交，引發(fā)新一輪的雜交裂解釋放，最終釋放出大量Cy5分子?；贗R的單分子熒光檢測(cè)方法能對(duì)Cy5分子進(jìn)行熒光成像，用于 PNK定量分析，檢出限為977×10Symbolm@@ 8 U/μL。該方法可以定量檢測(cè)癌細(xì)胞提取物中的 PNK，并可用于篩選 PNK抑制劑。 該方法靈敏度高、通用性強(qiáng)，通過(guò)設(shè)計(jì)合適的DNA底物和選擇合適的熒光基團(tuán)，可實(shí)現(xiàn)多種核苷酸激酶的同時(shí)檢測(cè)。

23比色法

比色法是通過(guò)比較或測(cè)量有色溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、直觀可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)[9]。將納米材料和生物酶催化反應(yīng)引入比色分析，極大的拓展了比色法的應(yīng)用范圍，為激酶的檢測(cè)開(kāi)辟了新途徑。歐麗娟等[50]建立了一種基于納米金凝聚變色效應(yīng)的比色方法，用于檢測(cè) PNK活性。無(wú) PNK時(shí)，由于靜電效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)，發(fā)卡探針修飾的金納米顆粒能夠穩(wěn)定存在溶液中，溶液顏色為納米金單分散狀態(tài)時(shí)的紅色。當(dāng) PNK存在時(shí)，發(fā)卡探針發(fā)生5'羥基磷酸化，隨后λ核酸外切酶將發(fā)卡探針從金納米顆粒切除，導(dǎo)致納米金顆粒因無(wú)DNA鏈保護(hù)而發(fā)生聚集，溶液變?yōu)樗{(lán)紫色。該方法簡(jiǎn)單直觀，儀器依賴(lài)程度低，檢出限為02 U/mL。Liu等[51]發(fā)展了一種基于G四鏈體/氯高鐵血紅素DNA酶的免標(biāo)記比色法，用于檢測(cè) PNK活性。他們?cè)O(shè)計(jì)了3'端G堿基富集的發(fā)夾探針以及和發(fā)夾探針部分互補(bǔ)的3'磷酸引物DNA。 PNK能將3'磷酸引物DNA催化為3'羥基引物DNA，并引發(fā)引物DNA的延長(zhǎng)反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)夾探針展開(kāi)和G四鏈體形成。G四鏈體可以和溶液中的氯高鐵血紅素結(jié)合形成G四鏈體/氯高鐵血紅素DNA酶，催化2O2氧化2，2'聯(lián)氮雙（3乙基苯并噻唑啉）6磺酸（ABS2endprint

Symbolm@@ ）反應(yīng)，導(dǎo)致溶液顏色變化。該方法無(wú)需復(fù)雜標(biāo)記，靈敏度高，檢測(cè)極限為001U/mL。該方法還可用于 PNK抑制劑的篩選。

2化學(xué)發(fā)光分析法

化學(xué)發(fā)光分析法通過(guò)測(cè)量化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)光物質(zhì)由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)發(fā)出的光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)[52]?；瘜W(xué)發(fā)光分析法無(wú)需額外光源，具有靈敏度高、信號(hào)收集迅速以及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[53]?；瘜W(xué)發(fā)光分析與其它技術(shù)聯(lián)用極大拓展了其應(yīng)用范圍。將擴(kuò)增技術(shù)引入化學(xué)發(fā)光分析，能夠顯著提高激酶檢測(cè)的靈敏度和特異性。ang等[5] 發(fā)展了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光分析法，用于超靈敏檢測(cè)PNK活性（圖）。 PNK催化單鏈DNA底物發(fā)生磷酸化反應(yīng)，隨后與掛鎖探針雜交，在DNA連接酶作用下形成一個(gè)封閉的環(huán)狀DNA。環(huán)狀DNA和掛鎖DNA可分別作為RCA反應(yīng)的模板和引物，生成具有DNA酶功能的單鏈DNA，并在氯高鐵血紅素分子協(xié)助下折疊成G四鏈體結(jié)構(gòu)，催化魯米諾2O2反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。該方法利用RCA的高效擴(kuò)增和DNA酶誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，可超靈敏檢測(cè) PNK活性，檢出限達(dá)220×10Symbolm@@ U/mL。該方法可用于篩選 PNK抑制劑和激活劑，并可應(yīng)用于實(shí)際樣品分析。

Li等[55]將功能化磁性微粒（MMPS）和催化發(fā)夾組裝（CA）反應(yīng)相結(jié)合，構(gòu)建了一種靈敏的DNA walker生物傳感器，可用于 PNK活性檢測(cè)。他們通過(guò)CA反應(yīng)將生物素標(biāo)記的發(fā)夾DNA組裝到MMPS表面，隨后利用鏈霉親和素生物素相互作用將辣根過(guò)氧化物酶組裝到DNA walker傳感器，催化化學(xué)發(fā)光體系產(chǎn)生信號(hào)。該方法靈敏度較高，特異性好，檢出限為0003 U/mL。

除了化學(xué)發(fā)光分析法，電致化學(xué)發(fā)光（ECL）也廣泛應(yīng)用于激酶的超靈敏檢測(cè)。ECL分析法通過(guò)檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行分析。ECL方法具有高靈敏度、低背景、檢測(cè)裝置簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間和空間可控等優(yōu)點(diǎn)[56～60]。聯(lián)吡啶釕絡(luò)合物及其衍生物是最常用的電致化學(xué)發(fā)光劑。Dong等 [61]發(fā)展了基于聯(lián)吡啶釕絡(luò)合物[Ru（bpy）3]2+功能化金納米粒子 （[Ru（bpy）3]2+AuNPs）的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)激酶CKII和PKA活性。在蛋白激酶和5'硫代三磷酸腺苷（APs）存在時(shí)，自組裝到金電極上的底物肽能夠特異性地發(fā)生硫代磷酸化反應(yīng)。通過(guò)靜電作用結(jié)合的[Ru（bpy）3]2+AuNPs復(fù)合體可與肽鏈中的硫代磷酸基團(tuán)通過(guò)AuS鍵連接，自組裝到金電極的表面，并在共反應(yīng)物三丙胺的作用下產(chǎn)生ECL信號(hào)。該方法靈敏度高，特異性好，對(duì)CKII和PKA的檢出限分別為0008和0005 U/mL。該方法可應(yīng)用于檢測(cè)血清樣本中CKII活性，也可用于CKII和PKA抑制劑的篩選。Liu等[62]利用釕衍生物標(biāo)記的蛋白作為ECL探針，用于檢測(cè)蛋白激酶PKA和CKII活性。蛋白激酶可將組裝到金電極表面的底物肽鏈中的絲氨酸磷酸化，單克隆磷酸化絲氨酸抗體能夠識(shí)別并結(jié)合肽鏈中磷酸化的絲氨酸，同時(shí)釕衍生物標(biāo)記的蛋白A（ECL探針）可特異性與磷酸化絲氨酸抗體結(jié)合，因而ECL探針可組裝到金電極表面實(shí)現(xiàn)ECL。該方法非常靈敏，對(duì)PKA和CKII的檢出限分別為0005和000 U/mL。 他們進(jìn)一步發(fā)展了ECL成像，實(shí)現(xiàn)了001～00 U/mL范圍內(nèi)PKA和CKII的同時(shí)檢測(cè)。該方法還可以用于激酶抑制劑的篩選和細(xì)胞中蛋白激酶活性的檢測(cè)。

25生物發(fā)光分析法

本課題組[63]發(fā)展了一種通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)磷酸化依賴(lài)的DNA連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn) PNK活性檢測(cè)的生物發(fā)光分析法（圖5）。在該方法中，兩個(gè)具有5'突出末端的發(fā)夾DNA探針作為磷酸基團(tuán)受體，dCP作為磷酸基團(tuán)供體。在無(wú) PNK存在時(shí)，發(fā)夾DNA探針中缺少5'磷?；?，不能觸發(fā)DNA連接反應(yīng)，無(wú)生物發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生。當(dāng) PNK存在時(shí)，兩個(gè)發(fā)夾DNA探針發(fā)生5'端磷酸化，在DNA連接酶作用下發(fā)生DNA連接反應(yīng)，釋放出AMP，其向AP轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)。通過(guò)監(jiān)測(cè)生物發(fā)光信號(hào)，可實(shí)現(xiàn) PNK活性的實(shí)時(shí)分析，檢出限為000 U/mL。該方法無(wú)需標(biāo)記，無(wú)需外部光激發(fā)，無(wú)自發(fā)熒光干擾，操作簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于PNK的定量分析、動(dòng)力學(xué)分析以及抑制劑的篩選。

26電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)[6]，在激酶檢測(cè)中具有廣泛應(yīng)用。Yin等[65]利用肽鏈磷酸化對(duì)羧肽酶Y（CPY）活性具有抑制作用的原理，發(fā)展了可對(duì)蛋白激酶CKII活性進(jìn)行靈敏檢測(cè)的電化學(xué)分析法。在CKII存在時(shí)，自組裝在金電極表面的CKII底物肽鏈發(fā)生絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，該位點(diǎn)的磷酸化可抑制CPY對(duì)底物肽鏈的消化，保持肽鏈和氧化還原探針e（CN）3 Symbolm@@ 6之間的排斥力，產(chǎn)生微弱的電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)無(wú)CKII存在時(shí)，CPY將底物肽鏈完全水解為氨基酸，導(dǎo)致排斥力消失，產(chǎn)生強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。通過(guò)監(jiān)測(cè)電化學(xué)信號(hào)可實(shí)現(xiàn)蛋白激酶的活性分析。該方法靈敏度高，檢出限為007 U/mL，能在復(fù)雜體系中對(duì)CKII進(jìn)行活性分析。

最近，微芯片和新型納米復(fù)合材料的引入極大豐富了激酶的電化學(xué)分析方法。Chand等[66]構(gòu)造了一種EIS傳感微芯片，通過(guò)檢測(cè)PKA特異性適配體修飾的EIS傳感器表面電荷的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)PKA的特異性分析，檢出限為2 U/mL。該傳感器還可與其它生物傳感器集成，用于多重分析。Liu等[67]利用納米金顆粒多壁碳納米管復(fù)合物（AuNPs/MWNs）的催化作用，發(fā)展了對(duì)蛋白激酶PKA進(jìn)行超靈敏檢測(cè)的電化學(xué)分析法，檢出限為009 U/mL。hou等[68]將Au@C納米復(fù)合材料、鏈霉親和素SiO2復(fù)合物及AuNPs生物素化β半乳糖苷酶相結(jié)合，構(gòu)建了可分析PKA活性的電化學(xué)生物傳感器，檢出限為001 U/mL。

27光電化學(xué)分析法endprint

光電化學(xué)（PEC）分析法是基于光活性物質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換性質(zhì)檢測(cè)待測(cè)物的一種方法，通過(guò)檢測(cè)光活性物質(zhì)被激發(fā)后產(chǎn)生的光電流，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的靈敏分析。光電化學(xué)分析法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)裝置成本低等優(yōu)點(diǎn)，在生化分析領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景[69～75]。光電化學(xué)分析法中常用的光活性物質(zhì)包括無(wú)機(jī)半導(dǎo)體材料（如CdS量子點(diǎn)和iO2納米粒子等）、有機(jī)半導(dǎo)體材料（聯(lián)吡啶釕衍生物和卟啉及其衍生物等）和復(fù)合半導(dǎo)體材料[7]。hou等[76]利用Bi2S3納米棒和AuNPs修飾的IO電極，結(jié)合生物素標(biāo)記的phostag構(gòu)建可靈敏檢測(cè)蛋白激酶PKA的PEC生物傳感器，檢出限達(dá)0017 U/mL。Yin等[77]利用gC3NAuNPs復(fù)合納米材料及生物素標(biāo)記的phostag和堿性磷酸酶（ALP）催化的信號(hào)放大原理，構(gòu)建了可對(duì)PKA靈敏檢測(cè)的信號(hào)增強(qiáng)型PEC生物傳感器，檢出限為0015 U/mL。最近，Li等[78]利用gC3NiO2復(fù)合納米材料、PAMAM樹(shù)狀大分子和堿性磷酸酶（ALP）引發(fā)的信號(hào)放大，構(gòu)建了可進(jìn)行PKA活性分析的新型PEC生物傳感器。該方法在溶液中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，有利于反應(yīng)充分進(jìn)行，操作步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高，檢出限為008 U/mL。huang等[79]利用AuNPs和gC3N納米片復(fù)合材料對(duì)電極進(jìn)行修飾，結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和氯高鐵血紅素/G四鏈體DNA酶輔助的生物催化沉淀，實(shí)現(xiàn)了 PNK的靈敏分析。該方法中，AuNPs表面的等離子共振增強(qiáng)效應(yīng)使PEC體系的光電流信號(hào)增大100%，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和DNA酶輔助的生物催化沉淀等多種信號(hào)放大技術(shù)的聯(lián)用顯著提高了檢測(cè)靈敏度，檢出限達(dá)10 mU/mL。

最近，Wang等[80]利用金屬有機(jī)骨架化合物（MOs）構(gòu)建了可超靈敏檢測(cè)蛋白激酶的PEC生物傳感器。在蛋白激酶PKA存在下，修飾于iO2/IO電極上的底物肽發(fā)生磷酸化反應(yīng)。由于具有r+表面缺陷，載有PEC光活性物質(zhì)[Ru（bpy）3]2+的鋯團(tuán)簇金屬有機(jī)骨架材料（[Ru（bpy）3]2+@UiO66）可通過(guò)螯合作用與磷酸化的底物肽結(jié)合，使[Ru（bpy）3]2+@UiO66與iO2/IO電極相連。[Ru（bpy）3]2+在可見(jiàn)光照射下產(chǎn)生受激電子，該電子注入到iO2導(dǎo)帶中產(chǎn)生光電流信號(hào)。鋯團(tuán)簇金屬有機(jī)骨架材料具有表面積大和孔隙率高的特點(diǎn)，能吸附大量[Ru（bpy）3]2+，顯著增強(qiáng)PEC體系的光電流信號(hào)，檢出限可達(dá)0009 U/mL。

3總結(jié)與展望

激酶是生物體內(nèi)重要的磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)催化底物分子的磷酸化過(guò)程廣泛參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞復(fù)雜過(guò)程的調(diào)控，是重要的藥物標(biāo)靶。激酶活性的靈敏檢測(cè)在疾病診斷、藥物研發(fā)和靶向治療等領(lǐng)域具有重要意義。由于易產(chǎn)生放射性廢物、操作繁瑣等問(wèn)題，傳統(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記法、放射自顯影像法等已逐漸被非放射性分析方法所取代。在新發(fā)展的激酶分析方法中，熒光分析法應(yīng)用最為廣泛，具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高，應(yīng)用范圍廣； （2）熒光團(tuán)無(wú)需特殊處理，環(huán)境友好； （3）基于熒光的分析技術(shù)（例如RE和LIM）有望實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)和成像。另外，其它新發(fā)展的方法也各具特點(diǎn)：比色法操作簡(jiǎn)單且成本低[81]； 化學(xué)發(fā)光分析法無(wú)需外光源，操作方便，分析快速，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化； 電化學(xué)分析法簡(jiǎn)單快速，成本較低[82]。目前，發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、靈敏度高的激酶活性分析方法仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。值得注意的是，近幾年涌現(xiàn)的新技術(shù)單分子檢測(cè)法具有靈敏度高和樣品消耗量低等優(yōu)點(diǎn)，在激酶活性分析領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。納米材料具有良好的光學(xué)性能和可控的表面吸附性能，為構(gòu)建新型激酶生物傳感器提供了新材料。一些高效擴(kuò)增技術(shù)如滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和雜交鏈反應(yīng)（CR）的引入，為發(fā)展高靈敏的激酶分析方法指引了新方向。我們堅(jiān)信隨著激酶分析方法的不斷發(fā)展，激酶在藥物開(kāi)發(fā)、臨床診斷以及生化分析等領(lǐng)域中的應(yīng)用前景也將越來(lái)越廣闊。

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