噻呋酰胺人工抗原的合成及酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立

李瀟瀟+丁書(shū)茂+楊旭+袁均林

摘要以化合物2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA）為噻呋酰胺的半抗原合成人工抗原，采用活潑酯法合成免疫原MCABSA，分別采用活潑酯法、混合酸酐法和N，N'羰基二咪唑/二甲氨基吡啶（CDI/DMAP）法合成3種包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。免疫動(dòng)物后，最終以包被原MCAOVA3篩選并獲得了具有高特異性的噻呋酰胺多克隆抗體，建立了檢測(cè)噻呋酰胺的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（icELISA）分析方法。本方法線性檢測(cè)范圍為008～1000 mg/L，半數(shù)抑制濃度（IC50）為139 mg/L，檢出限為008 mg/L，對(duì)自來(lái)水、湖水和小麥中的噻呋酰胺添加回收率在720%～1283%之間，檢測(cè)結(jié)果與PLC法具有良好的相關(guān)性（R2=0999）。本研究建立的icELISA方法可用于環(huán)境水樣與小麥等農(nóng)產(chǎn)品中噻呋酰胺殘留的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞噻呋酰胺； 人工抗原； 多克隆抗體； 酶聯(lián)免疫吸附分析

1引 言

噻呋酰胺是一種用途廣泛的含氟殺菌劑，可有效防治谷物、水果、蔬菜中的多種病害，對(duì)紋枯病有特效[1]。噻呋酰胺在水稻和花生中的半衰期分別為91～16 d和91～116 d，而在土壤中的半衰期更長(zhǎng)[2，3]。Yang等[]研究發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺可引起斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育畸形以及肝臟和腎臟組織損傷。隨著噻呋酰胺用量的增加，消費(fèi)者在日常生活中與之接觸的風(fēng)險(xiǎn)也在逐漸升高，使消費(fèi)者健康受到威脅，因此其殘留情況不容忽視。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 27632016[5]中規(guī)定噻呋酰胺在稻谷、糙米和馬鈴薯中的最大殘留量（MRL）分別為7、3和2 mg/kg。

現(xiàn)有的噻呋酰胺殘留的檢測(cè)方法包括高效液相色譜法（PLC）[6]、氣相色譜法（GC）[7]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）[8]等，此類方法操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力，而且依賴大型儀器和專業(yè)操作人員。建立簡(jiǎn)單、快速、靈敏和不依賴于大型儀器的方法，對(duì)于農(nóng)藥日常監(jiān)管和殘留的快速篩查都具有重要的實(shí)際意義，而酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）可以滿足上述要求[9]。

噻呋酰胺的分子結(jié)構(gòu)中無(wú)活潑基團(tuán)，難以直接與載體蛋白偶聯(lián)制備其抗體。Rejeb等[10]對(duì)噻呋酰胺的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使用的半抗原包含了噻呋酰胺的整個(gè)分子結(jié)構(gòu)，但僅用獲得的抗體制備了噻呋酰胺免疫吸附層析柱，并未詳述半抗原的制備方法，也未建立起ELISA檢測(cè)方法。本研究嘗試以噻呋酰胺分子結(jié)構(gòu)一半的化合物作為半抗原，通過(guò)不同的方法合成噻呋酰胺人工抗原，最終用獲得的高特異性抗體建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法（icELISA），可對(duì)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中的噻呋酰胺殘留進(jìn)行檢測(cè)。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

UV2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）； DNM9602型酶標(biāo)儀（北京普朗新公司）； Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

噻呋酰胺（98%，上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司）； 2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA，98%，上海書(shū)亞醫(yī)藥科技有限公司）； 氯甲酸異丁酯（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體IgG（酶標(biāo)二抗，武漢亦新生物技術(shù)公司）； N， N'羰基二咪唑（CDI，99%）、二甲氨基吡啶（DMAP，99%）、環(huán)己基碳二亞胺（DCC，99%）、N羥基琥珀酰亞胺（NS，98%）購(gòu)于成都西亞試劑公司； 三正丁胺（99%）、牛血清蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、福氏完全佐劑（CA）、福氏不完全佐劑（ICA）購(gòu)于Sigma公司； 底物顯色液為鄰苯二胺（OPD）顯色液（OPD mg，02 mol/L Na2PO 257 mL， 01 mol/L 檸檬酸23 mL，d2O 5 mL，30% 2O2 μL，現(xiàn)用現(xiàn)配）； 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。

22實(shí)驗(yàn)方法

221人工抗原的合成采用活潑酯法[11]合成免疫原MCABSA； 采用活潑酯法[11]、混合酸酐法[12]、CDI/DMAP法[13]分別合成包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。所有人工抗原均采用紫外吸收光譜掃描鑒定。

222動(dòng)物的免疫將只周齡的雌性Balb/c小鼠用MCABSA免疫，免疫方法按文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。

223小鼠血清效價(jià)及靈敏度的檢測(cè)第次免疫結(jié)束后第7天，將小鼠斷尾取血，收集血清。采用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清效價(jià)：將3種包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3用包被緩沖液稀釋到1 μg/mL [15]，包被酶標(biāo)板，℃包被過(guò)夜。用3% 脫脂奶粉封閉，250 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入2倍梯度稀釋的系列濃度（從1000～128000倍）的血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入二抗（100 μL/孔），37℃孵育1 h； 加入底物顯色液（100 μL/孔），37℃避光顯色15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L 2SO終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD92 nm值，以O(shè)D92 nm≈1的血清稀釋倍數(shù)為效價(jià)[16]。

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)：將上述效價(jià)檢測(cè)操作中加血清這一步驟改為加入50 μL 2倍效價(jià)濃度的血清和50 μL不同濃度的噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余各步不變。根據(jù)公式（1）計(jì)算抑制率（I）：

I （%）=[1-（ODinhitition hole/ODpositive hole）] ×100（1）

將產(chǎn)生目標(biāo)抗體的小鼠加強(qiáng)免疫后收集血清，選取最適的包被原包被酶標(biāo)板，建立icELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

22抗體特異性檢測(cè)選取與噻呋酰胺分子結(jié)構(gòu)類似的含氟農(nóng)藥精吡氟禾草靈、氟鈴脲、氟酰胺、三氟羧草醚，采用建立的方法測(cè)定，計(jì)算IC50值，按照公式（2）計(jì)算交叉反應(yīng)率（CR）：endprint

CR（%）=（IC50（hifluzamide）/IC50（Analyte））×100（2）

225加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)在自來(lái)水、武漢東湖水和小麥中添加不同濃度的噻呋酰胺。加標(biāo)水樣直接采用icELISA法或PLC法檢測(cè)。取10 g小麥粒樣品于錐形瓶中，添加噻呋酰胺后，靜置過(guò)夜。其提取步驟根據(jù)文獻(xiàn)[17]略有改動(dòng)：用20 mL丙酮振蕩提取并抽濾，重復(fù)操作一次，將兩次丙酮提取液置于分液漏斗，加入50 mL 5% NaCl溶液，用30 mL二氯甲烷萃取兩次。將兩次二氯甲烷相合并，經(jīng)無(wú)水Na2SO脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用含20%甲醇的PBS定容至10 mL，待測(cè)。以PLC法 [6]測(cè)定結(jié)果為對(duì)照。

3結(jié)果與討論

31噻呋酰胺半抗原的設(shè)計(jì)

噻呋酰胺的分子結(jié)構(gòu)中不含氨基、羧基、羥基等可與載體蛋白直接偶聯(lián)的活潑基團(tuán)。如果在其分子中引入活潑基團(tuán)，不僅操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力，還要對(duì)重塑的半抗原進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，如果獲得了某種分子一半結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的抗體，這種抗體對(duì)該分子也具有一定的識(shí)別能力，也可作為目標(biāo)物抗體[18～20]。對(duì)噻呋酰胺分子而言，含有羧基的MCA是它所特有的一半的結(jié)構(gòu)（圖1），因此本研究以MCA作為噻呋酰胺的半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，過(guò)程簡(jiǎn)便，省時(shí)有效。

32人工抗原的紫外吸收光譜鑒定

將載體蛋白與人工抗原用PBS調(diào)整到1 mg/mL后進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。如圖2所示，MCA、BSA和OVA的最大吸收峰分別在26、278和279 nm處，所有人工抗原的吸收曲線與相應(yīng)的半抗原和載體蛋白相比均發(fā)生明顯改變，MCABSA、MCAOVA1與各自載體蛋白相比最大吸收峰均發(fā)生偏移，MCAOVA2、MCAOVA3與OVA相比在相同的最大吸收峰處吸光度不同，表明所有人工抗原合成成功。

33小鼠血清效價(jià)及靈敏度測(cè)定

對(duì)于含有羧基的半抗原，文獻(xiàn)[21～23]均采用活潑酯法合成免疫原，而合成包被原時(shí)分別采用了活潑酯法、混合酸酐法和CDI/DMAP法，都成功獲得目標(biāo)抗體。鑒于此，本研究采用活潑酯法合成免疫原，嘗試用上述3種方法合成包被原，發(fā)現(xiàn)以MCAOVA1為包被原時(shí)，雖然檢測(cè)到所有小鼠血清效價(jià)很高，均在1∶6000以上，但將最佳稀釋度的血清加入不同濃度的噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液后，測(cè)得各孔抑制率均比較低，表明此包被原所測(cè)血清靈敏度低； 以MCAOVA2為包被原時(shí)檢測(cè)到所有小鼠血清效價(jià)均低于1∶1000，說(shuō)明該包被原檢測(cè)效果不佳； 以MCAOVA3為包被原時(shí)，檢測(cè)到1號(hào)、3號(hào)和號(hào)小鼠的血清效價(jià)均低于1∶1000，而2號(hào)小鼠的血清效價(jià)為1∶2000，并且對(duì)噻呋酰胺產(chǎn)生良好的抑制效果。

由此可見(jiàn)，在制備小分子抗體時(shí)，即使免疫動(dòng)物已經(jīng)產(chǎn)生目標(biāo)抗體，但須使用合適的方法合成的包被原方可檢測(cè)出； 此外，動(dòng)物的個(gè)體差異會(huì)影響抗體的產(chǎn)生。張存政等[2]在合成雙甲胺草磷人工抗原時(shí)，免疫原和包被原都采用活潑酯法合成，但在合成過(guò)程中加入了少量DMAP，這種改良的方法類似活潑酯法與CDI/DMAP法的結(jié)合，可減少雜分子與載體蛋白偶聯(lián)，有利于目標(biāo)抗體的產(chǎn)生。

35特異性

抗體對(duì)種與噻呋酰胺分子結(jié)構(gòu)類似的含氟農(nóng)藥及半抗原的交叉反應(yīng)結(jié)果如表1所示，與精吡氟禾草靈、氟鈴脲、三氟羧草醚和氟酰胺都無(wú)交叉反應(yīng)，表明本研究獲得的多克隆抗體對(duì)噻呋酰胺具有較高的特異性。

36實(shí)際樣品檢測(cè)

自來(lái)水、東湖水和小麥樣品經(jīng)PLC檢測(cè)均不含噻呋酰胺。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，icELISA法檢測(cè)噻呋酰胺回收率在720%～1283%之間，RSD<111%。部分加標(biāo)樣品（自來(lái)水：1 mg/L， 05 mg/L； 湖水：1 mg/L， 05 mg/L； 小麥：30 mg/kg， 3 mg/kg）經(jīng)PLC法驗(yàn)證，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖）， 說(shuō)明icELISA法具有良好的實(shí)用性。 與現(xiàn)有的色譜法相比，ELISA法操作步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需使用大型儀器， h內(nèi)即可完成檢測(cè)，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效。

結(jié) 論

本研究建立了噻呋酰胺人工抗原包被的icELISA檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)環(huán)境水樣與小麥等農(nóng)產(chǎn)品中噻呋酰胺殘留的快速檢測(cè)，為噻呋酰胺單克隆抗體的制備和建立不同類型的免疫分析方法提供了參考。

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