牛至草醇提物的抗氧化與抗炎、止咳祛痰作用研究*

早克然·司馬義，麥合蘇木·艾克木△，于 洋，阿不都熱依木·玉蘇甫

1.新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院 (烏魯木齊 830011)，2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥管理局(烏魯木齊 830001)

牛至草是一種維吾爾醫(yī)常用藥材，以牛至草(Origanum valgare)的干燥地上部分入藥，維吾爾語名為“買爾贊柱西”，藥性屬二級干熱，具有消散寒氣、開通濕阻、成熟及清除異常體液、利尿通經(jīng)、增強(qiáng)營養(yǎng)吸收、促進(jìn)機(jī)體自然隨和、止咳化痰、平喘利肺、消腫止痛等功效，用于粘稠異常體液性咳喘、感冒、頭痛、脈絡(luò)閉阻性胸悶氣短、形體消瘦、心煩身疲、食欲不振、尿少肢腫[1-3]。它也是新疆特色藥用植物之一，分布于天山、阿勒泰山區(qū)、準(zhǔn)噶爾西部等區(qū)[4]，資源豐富。文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，牛至草含有揮發(fā)油、多酚、黃酮、萜類等化合物，國內(nèi)外相關(guān)藥理活性研究主要集中于其揮發(fā)油類成分。在維吾爾醫(yī)及民間常以牛至草醇提物或水煎液用于治療咳喘、感冒、支氣管炎等疾病的治療，療效顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)對牛至草醇提物的體外抗氧化能力進(jìn)行了評價(jià)，同時(shí)對其總多酚、總黃酮含量進(jìn)行了測定，并對其抗炎、止咳、祛痰作用進(jìn)行了研究，以期為牛至草的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供參考。

材料與方法

1 材 料

1.1 儀器：OSB-2100恒溫水浴鍋(上海愛郎儀器有限公司)，DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋、DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，KQ320ODE數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)，AK-800A 400g搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)，VV-240型紫外可見光光度計(jì)(上海凌光技術(shù)有限公司)，艾柯純水儀(成都市康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)，KDC-2044型低速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。402A型霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑:抗敗血酸(上海藍(lán)季生物，批號(hào)：160625)，DPPH·(日本)，磷酸鹽緩沖液(中國，天津)，Tris-Hcl緩沖液(中國，北京Solarbio)，蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y01M7S10307)，沒食子對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110831-201204)，福林酚(源葉生物，批號(hào)：S28F8J)。急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號(hào)：14101248 0551)，苯酚紅(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20160510)，生理鹽水(國藥集團(tuán)新疆制藥有限公司，批號(hào)：1608008)。其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小鼠18～22g，均為清潔級、雌雄兼用，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證：SYXK(新)2011-0001]。

1.4 藥材:牛至草藥材購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)該醫(yī)院質(zhì)檢部鑒定為是唇形科植物牛至草(Origanum valgare)的干燥地上部分。

2 方 法

2.1 NZEt的制備:取牛至草藥材，切碎，粉碎，過篩。稱取3kg牛至草粉末，采用回流法以95%乙醇為提取溶劑提取兩次，料液比為1∶15，每次1.5h，濾過，合并濾液，濃縮至約1000 ml，抽濾。真空干燥，得NZEt，備用。

2.2 NZEt的體外抗氧化活性

2.2.1 對DPPH·自由基清除能力的測定[6-7]：用純水溶解NZEt，配置成不同濃度梯度的溶液，依次為0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml，置于冰箱保存?zhèn)溆?。DPPH·配置成0.1 mg/ml的DPPH甲醇溶液。取各濃度樣品2 ml到西林瓶中，加2 ml DPPH甲醇溶液，避光反應(yīng)30 min ，在517 nm處測定清除后OD值為(A1)；取各濃度樣品2 ml到西林瓶中，各加2 ml甲醇，測得樣品OD值為(A2)；以水為空白對照，以上水代替樣品溶液，取2 ml水到西林瓶中，加DPPH甲醇溶液2 ml，混合后測量未清除OD值為(A3)；預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，VC濃度為2.0 mg/ml時(shí)，清除率與各濃度牛至草醇提物的清除率最接近，故以此濃度VC作為陽性對照[11]，做3次平行。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.2.2 還原能力的測定[8]：用甲醇溶解NZEt，配制成不同濃度的溶解(0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)2 ml于10 ml試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)分別2ml，1%鐵氰化鉀溶液2 ml,混合后50℃水浴20 min，再加入10%三氯乙酸溶液2 ml，混合后3000 r/min離心10 min，取上清液2 ml于西林瓶中，加入純水2 ml和0.1%三氯化鐵0.4 ml，常溫反應(yīng)5 min，于700 nm處測定OD值。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，0.1 mg/ml VC的吸光度值與各濃度牛至草醇提物的吸光度值比較最為符合，故以此濃度VC作為陽性對照，做3次平行。

2.2.3 對·OH的清除能力的測定[9-10]：用蒸餾水溶解NZEt配制成不同濃度梯度的溶液(0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)。在具塞試管中加入4.5ml pH=7.4磷酸鹽緩沖液和1.5ml 1.5mmol/L的鄰二氮菲溶液，充分混勻，加入1ml 1.5mmol/L FeSO4溶液，立即混勻，加入1ml待測液，充分混勻，再加入1ml 0.02% 雙氧水；另做損傷管，其中加入1ml 0.02% 雙氧水與蒸餾水，未損傷管不加雙氧水直接加入2ml蒸餾水(未損傷管和損傷管均用磷酸鹽緩沖液調(diào)零)于37℃保溫60min,510nm處測定A值。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，0.1 mg/ml VC清除羥基自由基的效果與NZEt最高濃度時(shí)的清除率最接近，故以此濃度VC為陽性對照，每組設(shè)計(jì)3次平行，重復(fù)3次。清除率(%)=[(A樣-A損)/(A未-A損)]×100%。

2.3 NZEt總黃酮和總多酚含量測定

2.3.1 NZEt總黃酮含量的測定[11]：以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 ml容量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，搖勻即得對照品溶液。分別精密吸取1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml和5.0 ml置于10 ml比色管中，各加80%乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液0.5 ml，搖勻放置6min，再加10%Al(NO3)溶液0.5 ml，搖勻放置6min，加入4%NaOH溶液4 ml，搖勻放置15min，在510nm處測吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取樣品溶液1.0 ml于10 ml比色管中，各加80%乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液0.5 ml，搖勻放置6 min，再加10%Al(NO3)溶液0.5 ml，搖勻放置6min，加入4%NaOH溶液4 ml，搖勻放置15min，在510nm處測吸光度值。根據(jù)測得的吸光度值，按回歸方程計(jì)算樣品黃酮含量。

2.3.2 NZEt總酚含量的測定[12]：以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取0.070g的干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容于100 ml容量瓶中，搖勻,取5 ml放置50 ml棕色容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即得沒食子酸對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0分別置25 ml棕色容量瓶中，加10 ml蒸餾水，再依次加入FoLin試劑1 ml，7.5%Na2CO3溶液8 ml，蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻混合后，放置1h，以相應(yīng)的試劑為空白調(diào)零，在760nm處測吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取樣品溶液1.0 ml于25 ml棕色容量瓶中，同樣的加10 ml蒸餾水，再依次加入FoLin試劑1 ml，7.5%Na2CO3溶液8 ml，蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻混合后，放置1 h，以相應(yīng)的試劑為空白調(diào)零，在760nm處測定吸光度。根據(jù)測得的吸光度值，按回歸方程計(jì)算樣品總酚含量。

2.4 NZEt抗炎、止咳、祛痰作用研究

2.4.1 給藥劑量的確定：根據(jù)成年人每日攝食牛至草人體推薦量為約9g(生藥)，再按動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，確定小鼠每日用量，即牛至草醇提取物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠給藥劑量確定為高劑量為5.4 g/kg、中劑量為2.7 g/kg、低劑量為劑量1.35 g/kg。

2.4.2 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(抗炎實(shí)驗(yàn))：參照文獻(xiàn)[13]，取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對照組(0.9%生理鹽水)、陽性對照組(急支糖漿5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低劑量組(5.4 g/kg、2.7 g/kg、1.35 g/kg)；適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，灌胃給藥1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，于小鼠右耳兩側(cè)均勻涂抹二甲苯30μl致炎，左耳不涂作為對照。致炎1 h后頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，使用直徑為8 mm的打孔器摘取雙耳對稱耳片，精密稱取。耳片質(zhì)量以左右耳片重量差為腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率。以此判斷牛至草醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響。腫脹抑制率(%)=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%。

2.4.3 對濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響(止咳作用) ：取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(急支糖漿5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低劑量組(5.4 g/kg、2.7 g/kg、1.35 g/kg)；適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d。給藥體積均為0.02 ml/g，末次給藥1h，將小鼠逐一放入2.5L密閉干燥容器內(nèi)，恒壓噴入25%濃氨水氣霧，噴霧5s引咳，觀察并記錄其咳嗽潛伏期及2min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.4.4 對小鼠氣管段酚紅排泌量的影響(祛痰作用) ，取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對照組(0.9%生理鹽水)、陽性對照組(急支糖漿5.0 ml/kg)、NZEt高、中、低劑量組(5.4、2.7、1.35 g/kg)；適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d。體積0.02 ml/g末次給藥后30min，每只小鼠腹腔注射5%酚紅生理鹽水溶液0.2ml/20g體重，30min后處死小鼠，仰臥固定，頸部拉直，剝離周圍結(jié)締組織暴露氣管，解剖分離出自甲狀軟骨下至氣管分叉處的一段氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有2 ml 5% NaHCO3溶液的試管中，超聲波清洗15min,使氣管酚紅完全釋放，1000r/min 15min離心,取上清液，于分光光度計(jì)560nm處測定OD值，與酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，折算成酚紅含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析，以P<0.05位差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，由Excel生成圖標(biāo)。

結(jié) 果

1 NZEt的體外抗氧化活性

1.1 對DPPH·自由基的清除作用：見圖1。隨著NZEt濃度的升高，其清除能力就越高，呈上升趨勢，各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其濃度為2mg/ml時(shí)清除率高達(dá)61.37%，接近于相同濃度的陽性對照藥VC清除率62.0%。

圖1 NZEt的DPPH·自由基清除能力測定

1.2 還原能力：見圖2。隨著NZEt濃度的升高，其吸光度也一同升高，說明NZEt還原能力也逐漸增強(qiáng)，但其最高濃度時(shí)的吸光度(1.82)仍低于最低濃度時(shí)的陽性對照藥VC(2.93)，說明其還原能力小于陽性對照VC。

1.3 對·OH自由基的清除作用：見圖3。NZEt清除羥基自由基能力同樣隨著醇提物濃度的升高呈增高趨勢，其中濃度為2.0mg/ml的清除效果較高，清除率為41.3%，仍低于濃度為0.1mg/ml的VC清除率(53.4%)。

圖2 NZEt的還原能力測定

圖3 NZEt的羥基自由基清除能力測定

2 NZEt 總多酚、總黃酮含量 根據(jù)2.3.1的方法，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=0.2519C-0.0009，r2=0.9999，蘆丁吸光度(A)和濃度(C)在20μg/ml～100μg/ml范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)2.3.2的方法，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=0.0627C+0.0376，r2=0.999，沒食子酸吸光度(A)和濃度(C)在2.8gμg/ml～11.2μg/ml范圍內(nèi)線性良好。按上述回歸方程，計(jì)算NZEt總多酚和總黃酮含量。結(jié)果表明，其總多酚含量高達(dá)32.64mg沒食子酸/g，總黃酮含量為46.92mg蘆丁/g。

3 NZEt的抗炎、止咳、化痰作用 結(jié)果可見，與空白對照組比較，陽性對照組及NZEt三個(gè)劑量組腫脹度、咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)及酚紅含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，高、中、低劑量組腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量組咳嗽潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組咳嗽次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05)。高、中劑量組酚紅含量增多，差異具有顯著性(P<0.05)，而低劑量酚紅含量低于陽性對照組。各劑量組間比較，酚紅含量的差異具有顯著性。說明牛NZEt具有較顯著的抗炎、止咳、祛痰作用，具體見表1。

表1 牛至草醇提物抗炎、止咳、祛痰作用(

表1 牛至草醇提物抗炎、止咳、祛痰作用(

組 別劑量(g/kg) 抗炎耳腫脹度(mg)抑制率(%) 止咳咳嗽潛伏期(s)咳嗽次數(shù) 祛痰酚紅含量空白對照組— 7．3±2．4— 33．80±10．4636．80±13．42 1．32±0．19陽性對照組5．0 3．8±1．3?48．24 47．45±21．28?15．30±7．33? 4．41±1．01?低劑量組5．4 3．7±1．7?50．41 40．88±13．3725．80±9．53? 2．64±0．68?#中劑量組2．7 3．3±1．7?56．08 50．17±16．46?19．89±12．37? 3．44±1．12?#Δ高劑量組1．35 4．1±2．3?60．54 72．54±19．48?#Δ14．40±9．78?Δ 5．53±0．62?#Δ

注：以空白對照相比，*P<0.05；與陽性對照比，#P<0.05；與各劑量組間比較，ΔP<0.05

討 論

牛至草為維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，在維吾爾醫(yī)臨床和民間以其醇提物或水煎液用于治療咳喘、感冒、支氣管炎等異常黏液質(zhì)性疾病治療，療效顯著。它也是一種天然芳香植物之一，因其揮發(fā)油具有顯著的殺菌和抑菌作用，多應(yīng)用于飼料添加劑和食品防腐劑，國內(nèi)外相關(guān)藥理活性研究主要集中于其揮發(fā)油類成分。其揮發(fā)油的含量僅占藥材的很少一部份，這樣的使用狀況既浪費(fèi)了藥材資源，也不能使藥效得到全面發(fā)揮。因此，本研究將牛至草95%乙醇提取物為研究對象，采用DPPH· 、羥基自由基清除能力、還原能力及檢測方法考察其的抗氧化作用，并對其總黃酮、總多酚含量進(jìn)行測定；通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)、氨水致咳試驗(yàn)及氣管酚紅排泌試驗(yàn)，探討其抗炎、止咳、祛痰作用，旨在為牛至草的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供參考。

當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧化平衡紊亂時(shí)，產(chǎn)生的DPPH·、·OH等無法及時(shí)清除，造成其蓄積，過量的自由基將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。體內(nèi)蓄積的自由基與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NZEt具有一定的抗氧化活性，其清除DPPH·、·OH及鐵離子還原能力均隨著濃度的升高而增強(qiáng)趨勢，其中NZEt最高濃度(2mg/ml)時(shí)清除DPPH·能力接近于相同濃度的VC，而其清除·OH能力、還原能力均小于相同濃度的VC。

黃酮、多酚是植物的二次代謝產(chǎn)物，也是許多植物的活性成分或藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。NZEt中總黃酮和多酚含量分別高達(dá)46.92mg/g、32.64mg/g，可能是其發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但其具體抗氧化有效成分及作用機(jī)理等有待進(jìn)一步研究。

慢性支氣管炎等臨床呼吸系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，主要表現(xiàn)在咳、痰、喘癥狀，對其治療應(yīng)達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)

咳、祛痰等目的。本研究 NZEt 的抗炎、止咳、祛痰作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，NZEt 三個(gè)劑量組腫脹度、咳嗽次數(shù)及酚紅含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NZEt高劑量組的抗炎、止咳、祛痰作用優(yōu)于陽性對照組，說明NZEt具有較顯著的抗炎、止咳、祛痰作用。NZEt 的抗炎、止咳、祛痰作用，不僅為其臨床應(yīng)用及治療物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。至于其有效成分以及藥理作用的確定有待今后進(jìn)一步研究。

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