姜黃素衍生物L(fēng)6H4對(duì)2型糖尿病大鼠肝組織的保護(hù)作用

董細(xì)丹，陳曉湖，繆成鋒，徐菲菲，陳三妹，蔡國(guó)平

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；2.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 護(hù)理系，浙江紹興 312000）

2型糖尿病肝臟病變是2型糖尿病的一大并發(fā)癥，臨床上以非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最為常見(jiàn)，后者發(fā)病率在2型糖尿病患者中高達(dá)50%，在糖尿病伴肥胖患者中幾乎可達(dá)100%[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前較多學(xué)者支持“二次打擊”學(xué)說(shuō)：“第一次打擊”主要為脂肪的肝內(nèi)蓄積，這個(gè)過(guò)程同胰島素抵抗密切相關(guān)；“第二次打擊”為氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧將誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)炎癥，而各種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子又將活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC），導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成和降解失衡，最終促使肝纖維化發(fā)生。研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等極其廣泛的藥理活性，能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transferming grawth factor β1，TGF-β1）表達(dá)，從而抑制HSC活化，具有保護(hù)肝臟及抗纖維化的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)以L6H4治療糖尿病及高脂大鼠，探討L6H4對(duì)高脂及高糖引起的肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為糖尿病肝臟病變的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 雄性SPF級(jí)SD大鼠40只（購(gòu)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批準(zhǔn)文號(hào)：wydw2014-0052），體質(zhì)量180～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、高脂組、高脂治療組、糖尿病組及糖尿病治療組。正常對(duì)照組正常飲食，其余各組高糖高脂喂養(yǎng)，糖尿病組及糖尿病治療組喂養(yǎng)4周后加單次30 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）誘導(dǎo)2型糖尿病模型，檢測(cè)尾靜脈空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平，以FBG＞16.7 mmol/L為造模成功，成模后高脂治療組和糖尿病治療組L6H4+1%羧甲基纖維素鈉（L6H4由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院梁廣教授惠贈(zèng)，1%羧甲基纖維素鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）連續(xù)灌胃治療8周，其余3組以等劑量1%羧甲基纖維素鈉灌胃。12周末，處死大鼠[3]。

1.2 血生化指標(biāo)檢測(cè) 收集各組大鼠血清，以日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血總甘油三脂（total triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）水平以及血谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amino transferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate amino transferase AST）、血漿白蛋白（albumin，ALB）等肝功能指標(biāo)；微量血糖儀測(cè)FBG，放射免疫法（試劑盒購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司）測(cè)空腹胰島素（free blood insulin，F(xiàn)INs）并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（blood indexes of insulin resistance homeostasis model assessmentestimated insulin resistance，HOMAIR）。

1.3 HE染色標(biāo)本制備[4]大鼠處死后分離肝臟，0.9%氯化鈉溶液清洗稱重后，取部分肝組織置于4%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋后，制成厚約3 μm的石蠟切片，行HE染色，中性樹(shù)脂固封。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.4 油紅O染色標(biāo)本制備 肝臟組織經(jīng)OTC包埋，冰凍切片機(jī)（機(jī)箱溫度約-20 ℃）制作冰凍切片（厚度約6 μm），置于油紅O染液（油紅0.05 g+異丙醇1 000 mL加熱至95 ℃溶解后過(guò)濾）中1 h，水洗，置于Harris蘇木素液中進(jìn)行核復(fù)染約10 s，水洗，用甘油明膠（明膠10 g+蒸餾水60 mL+甘油70 mL+石碳酸0.25 g）封固。

1.5 Masson染色標(biāo)本制備 石蠟切片常規(guī)脫蠟，經(jīng)蘇木素染色5 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗10 min，置于Masson液（變色酸2R 0.25 g+磷鎢酸0.5 g+冰醋酸0.5 mL+蒸餾水50 mL）中染色5 min，沖洗數(shù)秒，1%亮綠液染色1 min（觀察顏色并控制時(shí)間），梯度乙醇脫水各1 min，置于石碳酸二甲苯中3 s，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。光鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判讀，膠原纖維呈藍(lán)綠色，肝細(xì)胞呈紅色。

1.6 肝組織電鏡標(biāo)本制備 切取小塊肝組織（大小約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm），2.5%戊二醛4 ℃固定1 h，鋨酸后固定，PBS漂洗，丙酮酸梯度脫水，Epon812包埋機(jī)包埋，半薄切片定位，RMC-XL型超薄切片機(jī)切片，在H-7500型透射電鏡下觀察肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色（EnVision二步法） 常規(guī)石蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫液中阻斷、高溫高壓抗原修復(fù)后，滴加一抗[抗TGF-β1抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，稀釋濃度1∶150）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2（tissue inhibitor metallo protemase 2，TIMP-2）抗體（美國(guó)Santa cruz公司產(chǎn)品，稀釋濃度1∶50）及抗基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體（美國(guó)abcam公司產(chǎn)品，稀釋濃度1∶200）]，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下復(fù)溫5 min，PBS液沖洗5 min后滴加兔二抗，37 ℃烤箱孵育30 min，DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算5個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡領(lǐng)域的光密度（OD）。結(jié)果判定：胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，結(jié)果均用 ±s表示。組間差異用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)和制圖使用Graph Pad Prism 5軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血生化檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 血糖血脂相關(guān)指標(biāo)：高脂組與糖尿病組大鼠的FBG、FINs、HOMA-IR、TG、TC、LDL-c濃度以及LDL-c/HDL-c值均較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），糖尿病組大鼠的HDL-c濃度較正常對(duì)照組降低（P＜0.01）；高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，F(xiàn)BG、HOMA-IR、TG、TC、LDL-c濃度以及LDL-c/HDL-c值均顯著下降（P＜0.01），糖尿病治療組大鼠與糖尿病組比HDL-c濃度顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)INs濃度顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.1.2 大鼠血清肝功能指標(biāo)：與正常對(duì)照組比較，高脂組、糖尿病組大鼠血清ATL、AST明顯升高（P＜0.01），ALB水平顯著下降（P＜0.01）；高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，ATL、AST水平明顯降低（P＜0.01），ALB水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.2 大鼠肝組織光鏡下形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈立方形，排列整齊，油紅O染色未見(jiàn)明顯脂滴，Masson染色示僅在門靜脈及匯管區(qū)周圍見(jiàn)少量綠色膠原纖維；高脂組肝細(xì)胞有明顯脂肪變性，細(xì)胞核被擠向一側(cè)，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，油紅O染色示胞漿內(nèi)大小不等的橘紅色脂滴，Masson染色未見(jiàn)明顯膠原增生；糖尿病組肝細(xì)胞脂肪變性更加明顯，可見(jiàn)氣球樣變，肝索結(jié)構(gòu)破壞，纖維間隔增寬，油紅O染色示胞漿內(nèi)橘紅色脂滴較高脂組更加密集，Masson染色示粗大的綠色膠原行走于匯管區(qū)，肝細(xì)胞間亦可見(jiàn)膠原纖維相互連接。高脂治療組、糖尿病治療組大鼠肝臟病變有所減輕，油紅O染色示胞漿內(nèi)脂滴減少，Masson染色示膠原纖維沉積減輕，纖維間隔變窄。見(jiàn)圖1-3。

表1 各組大鼠血糖血脂相關(guān)指標(biāo)比較（n=8， ±s）

表2 各組ALT、AST及ALB水平比較（n=8， ±s）

2.3 大鼠肝組織透射電鏡下形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞核為橢圓形，線粒體為橢圓形，嵴豐富，數(shù)量較多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀排列；高脂組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)含大小不等的脂質(zhì)顆粒，部分融合形成大的脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，線粒體腫脹，內(nèi)室擴(kuò)張；糖尿病組大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)顆粒數(shù)量較高脂組增多，核固縮，染色質(zhì)加深，線粒體腫脹，嵴排列紊亂、模糊、中斷；L6H4干預(yù)后，高脂治療組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒數(shù)量減少，線粒體增多，腫脹明顯減輕，板狀嵴清晰，糖尿病治療組核固縮減輕，線粒體增多，見(jiàn)圖4。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肝組織中TGF-β1僅在血管周圍少量表達(dá)，TIMP-2僅在血管壁和膽管壁少量表達(dá)，MMP-2在匯管區(qū)少量陽(yáng)性表達(dá)；TGF-β1在高脂組、糖尿病組肝組織的中央靜脈周圍及增厚的纖維間隔內(nèi)表達(dá)明顯增加（P＜0.01），TIMP-2在高脂組肝組織中較正常對(duì)照組表達(dá)稍增加，在糖尿病組中表達(dá)明顯增加（P＜0.01），MMP-2在高脂組及糖尿病組中表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）；L6H4干預(yù)后，高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，TGF-β1及TIMP-2表達(dá)量明顯減少（P＜0.01），MMP-2表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），見(jiàn)表3。

3 討論

圖1 各組大鼠肝組織HE染色觀察（×100）

糖尿病性肝疾病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，有20%～30%的患者存在肝內(nèi)炎癥、纖維組織增生，若無(wú)及時(shí)的干預(yù)，可發(fā)展為肝纖維化，最終導(dǎo)致肝功能衰竭[5]。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖環(huán)境是肝臟受損的始動(dòng)因素，胰島素抵抗使機(jī)體對(duì)糖利用障礙，大量脂肪被動(dòng)員，致使游離脂肪酸在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)蓄積，并通過(guò)多種途徑觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化[6]，此過(guò)程不僅可以誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，直接損害肝細(xì)胞，又可以激活HSC，使其基因表達(dá)和表型發(fā)生改變，合成ECM增多，釋放細(xì)胞因子、膠原酶及其抑制物等，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[7]。

TGF-β1為目前已知最強(qiáng)的致肝纖維化因子，與肝臟纖維化病理分期正相關(guān)[8]，由活化的竇內(nèi)皮細(xì)胞及損傷的肝細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活HSC；而活化的HSC可旁分泌活化及自分泌TGF-β1，持續(xù)激活HSC，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成[9]。此外，TGF-β1還可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor metalloprotemases，TIMPs）表達(dá)和或抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)，減少ECM的降解，同時(shí)可通過(guò)跨膜受體，參與并起始TbRI I-ALK5-Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)通路，直接調(diào)節(jié)膠原蛋白、ECM基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，致使ECM生成和降解失衡，進(jìn)一步加重肝纖維化[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂組及糖尿病組大鼠TGF-β1表達(dá)增多，L6H4治療后，高脂治療組、糖尿病治療組大鼠肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)顯著降低，提示L6H4可能通過(guò)抑制TGF-β1，抑制HSC活化和分泌ECM，進(jìn)而減輕肝纖維化。

圖3 各組大鼠肝臟組織Masson染色觀察（×100）

TIMPs/MMPs失衡是導(dǎo)致肝纖維化的一個(gè)重要機(jī)制[12]，而TIMP-2在肝內(nèi)表達(dá)且對(duì)MMPs具有較強(qiáng)的抑制活性[13]，是抗肝纖維化研究的一個(gè)熱點(diǎn)。NIE等[14]及HU等[15]分別通過(guò)反義核苷酸及合成的特異siRNA靶向抑制TIMP-2基因，發(fā)現(xiàn)抑制TIMP-2表達(dá)可以顯著減少ECM中I型及IV型膠原的沉積。IV型膠原沉積是肝血竇毛細(xì)血管化的關(guān)鍵因素，在纖維化早期，以Col IV為主的功能性基底膜破壞，Col IV與LN沉積共同構(gòu)成連續(xù)的基底膜致使肝血竇毛細(xì)血管化，影響肝竇血流和肝內(nèi)外物質(zhì)交換，加重肝功能損害，是肝纖維化的分子病理學(xué)基礎(chǔ)[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L6H4干預(yù)后，高脂治療組及糖尿病治療組大鼠肝組織TIMP-2表達(dá)顯著下降，MMP-2蛋白表達(dá)顯著上升，Masson染色也顯示治療組大鼠肝組織的膠原纖維沉積較高脂組及糖尿病組明顯減少，且TIMP-2的表達(dá)變化趨勢(shì)同TGF-β1一致。CHENG等[17]體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制HSC的增殖活化，提高M(jìn)MP-2、MMP-9等的活性，抑制TGF-β1表達(dá)，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)提示L6H4可能通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá)，直接或通過(guò)抑制HSC的活化，下調(diào)TIMP-2，減少對(duì)MMP-2等MMPs的抑制作用來(lái)抑制高脂及糖尿病大鼠肝的纖維化。

臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，姜黃素有明顯降脂、降血糖的藥理作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂治療組及糖尿病治療組的血TG、TC、LDL-c水平明顯下降，糖尿病治療組HDL-c明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高脂治療組HDL-c稍有上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與姜黃素上調(diào)載脂蛋白A1和膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)HDL的合成，同時(shí)上調(diào)肝內(nèi)的清道夫受體B I，增加肝細(xì)胞對(duì)HDL的選擇性攝取[19]相關(guān)。脂肪組織是胰島素抵抗的源頭，其慢性炎癥產(chǎn)生的一些炎癥因子將影響到胰島素作用通路促使胰島素抵抗，導(dǎo)致高血糖和高脂血癥，而后兩者則進(jìn)一步刺激胰島，增加胰島素分泌導(dǎo)致高胰島素血癥，本實(shí)驗(yàn)示L6H4可明顯下調(diào)高脂組及糖尿病組大鼠FBG、HOMA-IR水平，并明顯下調(diào)糖尿病組FINs水平，這可能同L6H4下調(diào)血糖及血脂，減少對(duì)胰島刺激有關(guān)。此外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L6H4可明顯改善模型組大鼠的肝功能及肝組織炎癥、變性壞死等病理改變，同王玲等[20]以姜黃素衍生物B06治療聯(lián)合高糖高脂喂養(yǎng)與STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠研究結(jié)果一致。

圖4 各組大鼠肝細(xì)胞透射電鏡觀察（×10 000）

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-2和MMP-2的表達(dá)比較（n=8， ±s）

綜上所述，L6H4能調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗及糖脂代謝，對(duì)高脂及糖尿病大鼠的肝臟具有保護(hù)作用，能明顯減輕2型糖尿病大鼠肝臟纖維化，抑制TGF-β1及TIMP-2的表達(dá)，上調(diào)MMP-2的表達(dá)可能是其主要作用機(jī)制之一。

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