干擾性小核糖核酸靶向抑制趨化因子受體4基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

魯保才，盧振民，張愛(ài)民，余文發(fā)，連 榮，史海旭，李 靖，王慧敏，袁東杰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南 衛(wèi)輝 453100)

鼻咽癌是一種地方性高發(fā)的鼻咽部鱗狀上皮癌，常發(fā)生在鼻咽部頂壁和咽隱窩。主要治療方法是放射治療或放射治療聯(lián)合化學(xué)治療，但對(duì)于晚期病灶、轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)患者的治療效果很差，且不良反應(yīng)重[1]。鼻咽癌的發(fā)生是包括環(huán)境因素、癌基因、抑癌基因、基因的易感性、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)在內(nèi)的多因素作用的結(jié)果。因此，闡明鼻咽癌發(fā)生的分子機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)是該病治療的關(guān)鍵。趨化因子受體4(chemine receptor 4，CXCR4)是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1唯一的趨化因子受體，參與各種生理及病理過(guò)程[2]。近年來(lái)研究顯示，乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多種腫瘤中CXCR4高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的播散、正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞的非隨機(jī)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[3-5]。也有研究指出，鼻咽癌中CXCR4也有高表達(dá)，其表達(dá)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。本研究擬采用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)靶向沉默人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z中CXCR4基因的表達(dá)，觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2014年1月至2016年12月保存的鼻咽癌及相應(yīng)的癌旁組織各42例，男28例，女14例，年齡19～85(42.2±12.1)歲。鼻咽癌患者經(jīng)病理證實(shí)均為鼻咽部低分化鱗癌，均未接受任何治療，且為首次確診，所有樣本的實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2試劑和儀器人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (cell counting kit-8，CCK-8)和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；多功能酶標(biāo)儀(Synergy HT)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tec公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)鼻咽癌及癌旁組織中CXCR4mRNA表達(dá)參照Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取患者鼻咽癌組織和癌旁組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照GenBank中的基因序列，利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)目的基因CXCR4及內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的RT-PCR引物，送上海生工生物工程有限公司合成。CXCR4引物序列：上游為5′-TGGCCTTATCCTGCCTGGTAT-3′，下游為5′-GGAGTCGATGCTGATCCCAAT-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游為5′-GAAGATGGTGATGGGAT-TTC-3′。定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，以上共35個(gè)循環(huán)。72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。根據(jù)相對(duì)模板量2-ΔΔCt計(jì)算CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z在37 ℃，95%濕度，含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1.0×108L-1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底面積達(dá)85%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為空白對(duì)照組(細(xì)胞未做任何處理)、陰性對(duì)照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA序列)和CXCR4轉(zhuǎn)染組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCR4的靶向siRNA序列)。具體操作按照LipofectamineTM2000試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.5Westernblot法檢測(cè)鼻咽癌組織、癌旁組織及各組細(xì)胞中CXCR4、MMP-2、MMP-9、β-catenin及CyclinD1蛋白表達(dá)用細(xì)胞裂解液分別處理鼻咽癌組織、癌旁組織和細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取50 μg上樣蛋白至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉，分別加入CXCR4、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1(均按照1500稀釋)和GAPDH(11 000稀釋)一抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌(3次×10 min)，加入 15 000 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃ 孵育1 h，洗膜后在暗室X片曝光1 min左右，顯影、定影后成像拍照。

1.6CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以1×107L-1濃度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的CNE-2Z細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h進(jìn)行同步化處理，分別于轉(zhuǎn)染后48 h每孔細(xì)胞中加入CCK-8試劑 10 μL，培養(yǎng)箱孵育1 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度，重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率 =(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞/對(duì)照組細(xì)胞)×100%。

1.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力4 ℃融化Matrigel膠，與RPMI-1640培養(yǎng)液按照14比例稀釋，取50 μL稀釋后的膠鋪在Transwell小室上層。常溫放置10～15 min風(fēng)干，轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室的上層，下室中加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h，洗滌，棉球輕輕擦掉上室內(nèi)的細(xì)胞，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，隨機(jī)取不同的6個(gè)視野(×200)觀察；并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，求均值。

2 結(jié)果

2.1CXCR4mRNA和蛋白在鼻咽癌及癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。鼻咽癌及相應(yīng)的癌旁組織中CXCR4 mRNA表達(dá)分別為5.526±0.143、0.953±0.091，蛋白表達(dá)分別為0.522±0.047、0.053±0.011，鼻咽癌組織中CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：CXCR4 mRNA表達(dá)；B：CXCR4蛋白表達(dá)。

圖1CXCR4在鼻咽癌中的表達(dá)

Fig.1ExpressionofCXCR4inhumannasopharyngealcarcinomatissue

2.2轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后CNE-2Z細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)分別為0.383±0.031、0.369±0.029和0.037±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2各組CNE-2Z細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)

Fig.2ExpressionofCXCR4proteininCNE-2Zcellsineachgroup

2.3各組細(xì)胞增殖能力比較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率分別為(95.62±3.23)%、(93.45±3.13)%和(61.18±4.44)%，CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組細(xì)胞侵襲能力比較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Transwell侵襲數(shù)分別為225±15、217±14和 102±12，MMP-2蛋白表達(dá)分別為0.475±0.042、0.498±0.041和0.223±0.027，MMP-9蛋白表達(dá)分別為0.481±0.036、0.462±0.034和0.330±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MMP蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3各組CNE-2Z細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

Fig.3ExpressionofMMP-2andMMP-9proteininCNE-2Zcellsineachgroup

2.5轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)分別為0.412±0.036、0.407±0.038和0.174±0.025，Cyclin D1蛋白表達(dá)分別為0.153±0.021、0.145±0.022和0.036±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組細(xì)胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4各組CNE-2Z細(xì)胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)

Fig.4Expressionofβ-cateninandCyclinD1proteininCNE-2Zcellsofeachgroup

3 討論

趨化因子及其受體在大部分腫瘤中有表達(dá)，其表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此，以趨化因子或其受體為靶點(diǎn)，通過(guò)抑制趨化因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)而調(diào)節(jié)趨化因子系統(tǒng)的功能對(duì)于惡性腫瘤的防治具有重要意義。研究顯示，CXCR4是在組織中表達(dá)最廣泛的細(xì)胞趨化因子受體之一，與其配體結(jié)合激活后可形成假偽足，影響多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、遷移[7]。在多種惡性腫瘤中有CXCR4基因的異常表達(dá)[8-9]。研究顯示，抑制CXCR4基因的表達(dá)可顯著降低卵巢癌、胃癌、腎癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力[10-12]。CXCR4基因在鼻咽癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移、放射治療史有關(guān)，可作為判斷鼻咽癌預(yù)后的指標(biāo)[13]。但CXCR4對(duì)鼻咽癌侵襲及其機(jī)制研究尚未清楚。RNA干擾是由RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默調(diào)控，具有高度的特異性和有效性，是研究基因功能有效的途徑[14]。

腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是惡性腫瘤的一個(gè)重要生物學(xué)特性，也是治療失敗的重要因素。惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲是由多步驟、多階段控制的復(fù)雜過(guò)程，其中細(xì)胞外基質(zhì)降解是侵襲的關(guān)鍵。MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基膜中的大多數(shù)蛋白質(zhì)，在腫瘤中由于其表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[15-16]。MMP-2和MMP-9在MMPs家族中研究的較多，既往研究表明，鼻咽癌中MMP-2和MMP-9過(guò)表達(dá)與鼻咽癌的浸潤(rùn)生長(zhǎng)、淋巴轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后等有關(guān)，抑制其表達(dá)可降低鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17-18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染CXCR-4-siRNA抑制鼻嗯癌細(xì)胞中CXCR4 mRNA和蛋白水平，抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，顯著降低了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力，提示CXCR4基因在鼻咽癌的侵襲能力可能與其調(diào)控MMP-2和MMP-9密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路由Wnt蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、跨膜受體胞質(zhì)蛋白和下游的靶基因組成，是一條經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，與腫瘤、衰老和退化、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān)[19]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心原件，在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均有分布，當(dāng)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，可導(dǎo)致β-catenin的大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，最終激活和啟動(dòng)下游的Cyclin D1、c-myc基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。既往研究認(rèn)為，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可降低人鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡能力[20]。本研究結(jié)果提示，抑制CXCR4表達(dá)后β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力也對(duì)應(yīng)降低。因此，CXCR4基因可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與到鼻咽癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲能力的調(diào)控；另外，本研究也觀察到鼻咽癌細(xì)胞的惡性侵襲能力與MMP-2和MMP-9表達(dá)相關(guān)，但其具體調(diào)控方式和機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，抑制鼻咽癌CXCR4表達(dá)可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。CXCR4基因可能成為鼻咽癌檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)及作為分子治療的潛在靶點(diǎn)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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