肝細(xì)胞生長因子重組腺病毒對高血壓高血脂大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬凋亡蛋白表達的影響

孫允芹，王耀峰，郭寒冰，趙 爽，李 彤

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)三科，河南 衛(wèi)輝 453100)

高血壓和高血脂是腦血管疾病的危險因素，若不及時治療則可引起腦組織損害。血管性認(rèn)知功能障礙是由腦血管疾病引起的在腦組織損害的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。海馬區(qū)與學(xué)習(xí)認(rèn)知功能關(guān)系最為密切，國內(nèi)外研究顯示，海馬功能區(qū)神經(jīng)元受到損傷時，其行為學(xué)表現(xiàn)出嚴(yán)重障礙[2]。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多功能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對缺血性腦組織有神經(jīng)保護和修復(fù)作用，其機制是通過抑制細(xì)胞的凋亡和促進腦的側(cè)支循環(huán)實現(xiàn)的[3]。肝細(xì)胞生長因子重組腺病毒(adenovirus vector encoding HGF gene，Ad-HGF)在治療缺血性疾病方面已取得良好療效，目前已進入臨床Ⅱ期階段。本研究通過復(fù)制高血壓高血脂大鼠模型，觀察其認(rèn)知功能的改變；并將Ad-HGF經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔，觀察其對大鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，為Ad-HGF治療腦血管疾病的安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只，18月齡，體質(zhì)量300～350 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2012-0001]。實驗期間所有動物自由飲食、飲水，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2主要試劑及儀器Ad-HGF (滴度0.5×1014pfu·L-1，北京奧洛英生物科技有限公司)，通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(基因科技上海股份有限公司)，兔抗鼠多克隆bcl-2抗體和兔抗鼠多克隆bax抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)，膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶、豬油、蛋黃粉、蔗糖(北京索萊寶科技有限公司)。Morris水迷宮實驗裝置及圖像采集處理系統(tǒng)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院提供，55i、DS-Fi1c熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.3動物分組和造模30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組、模型組和Ad-HGF組，每組10只，參考文獻[4]制備高血壓高血脂大鼠模型。具體操作：模型組和Ad-HGF組大鼠術(shù)前1 d禁食，手術(shù)當(dāng)天禁水，以100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉(3.4 mL·kg-1)，無菌條件下行雙側(cè)腎動脈狹窄術(shù)，造成實驗性腎性高血壓。術(shù)后1周給予高脂飼料[高脂配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[5]：普通飼料(76.3%)、膽固醇(3.0%)、膽酸鈉(0.5%)、丙硫氧嘧啶(0.2%)、豬油(10.0%)、蛋黃粉(5.0%)、蔗糖(5.0%)]喂養(yǎng)制備高血脂模型，對照組大鼠僅分離雙側(cè)腎動脈，不予狹窄，術(shù)后給予普通飼料喂養(yǎng)。2組大鼠均喂養(yǎng)16周。造模后，Ad-HGF組大鼠經(jīng)小腦延髓池一次性注入Ad-HGF 10 μL(0.25×1014pfu·L-1)；對照組和模型組大鼠分別經(jīng)小腦延髓池一次性注入生理鹽水10 μL。

1.4Morris水迷宮實驗評估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力各組大鼠分別于給藥后10 d進行Morris水迷宮實驗，Morris水迷宮實驗參照文獻[6]。實驗開始前，大鼠均進行1次適應(yīng)性游泳，目的是剔除不合格的動物(主要是視力問題)。

定位航行實驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力，每日1次，共4 d。大鼠分別從4個不同象限面向池壁放入水中，觀察大鼠2 min內(nèi)找到隱匿平臺所需時間(逃避潛伏期)，若大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺，將其引致平臺，且記錄潛伏期為120 s。

空間探索實驗檢測大鼠的空間位置記憶能力，定位航行實驗后，撤去隱匿平臺，任選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠2 min內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間。

1.5大鼠海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax表達測定行為學(xué)實驗結(jié)束后，大鼠進行腹腔麻醉并置于灌注臺上，開胸充分暴露心臟，在心臟搏動狀態(tài)下，左手持鑷子固定心臟，右手持灌流針經(jīng)心尖部將其插至主動脈根部，剪開右心耳，由助手協(xié)助迅速打開恒流泵開關(guān)，以200 r·min-1的速度灌注生理鹽水直至血液沖洗干凈后，改用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定液灌注，并下調(diào)恒流泵轉(zhuǎn)速至 60 r·min-1，當(dāng)大鼠出現(xiàn)四肢抽動后，轉(zhuǎn)速調(diào)為10 r·min-1，緩慢灌注持續(xù)20 min后停止，斷頭小心取腦組織浸入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛緩沖固定液中固定24 h以上。取出腦組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，完成蠟塊制備。腦組織蠟塊經(jīng)修片、切片、展片、烤片，完成石蠟切片制作。石蠟切片進行免疫組織化學(xué)染色，分別在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)bcl-2和bax蛋白的陽性表達結(jié)果，并計算bcl陽性細(xì)胞數(shù)與bax陽性細(xì)胞數(shù)的比值(bcl/bax)。陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色。每張切片隨機選取5個視野，400倍光鏡下進行陽性細(xì)胞計數(shù)，取平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠剔除情況手術(shù)中死亡3只(對照組2只，Ad-HGF組1只)；Morris水迷宮實驗剔除4只(對照組2只，模型組1只，Ad-HGF組1只)；蛛網(wǎng)膜下腔注射死亡5只(模型組3只，Ad-HGF組2只)。

2.2各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較結(jié)果見表1。模型組大鼠逃避潛伏期長于對照組，穿越平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間少于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ad-HGF組大鼠逃避潛伏期短于模型組，穿越平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間多于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

注：與對照組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01。

2.3各組大鼠海馬CA1區(qū)bcl-2和bax蛋白表達比較見表2和圖1。2種蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達，其中bcl-2蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上亦有少量表達。與對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)bcl-2和bax蛋白表達陽性細(xì)胞數(shù)均增多，bcl-2/bax比值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，Ad-HGF組大鼠海馬CA1區(qū)bcl-2蛋白表達陽性細(xì)胞數(shù)升高，bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)降低，bcl-2/bax比值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2各組大鼠海馬CA1區(qū)bcl-2和bax蛋白表達陽性細(xì)胞數(shù)比較

注：與對照組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01。

圖1各組大鼠海馬組織中bcl-2和bax蛋白表達(免疫組織化學(xué)法，×400)

Fig.1Expressionofbcl-2andbaxproteininhippocampusofratsineachgroup(immunohistochemistry，×400)

3 討論

高血壓和高血脂是導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能障礙最重要的危險因素，其機制可能是：(1)長期高血壓使腦微血管痙攣、缺血，小動脈受損，發(fā)生變性壞死，管腔狹窄，阻力增加，腦循環(huán)血流量減少。同時，受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞使血流處于高凝狀態(tài)，加快動脈硬化程度，造成腦內(nèi)多發(fā)性小動脈壞死和腦組織損傷。(2)高血脂的脂質(zhì)成分在血管壁沉積，形成粥樣斑塊使管腔狹窄閉塞，增加了缺血性腦血管疾病的發(fā)病概率。高脂血癥使血黏度增加，血流速減慢，同時因纖維蛋白原的濃度升高，容易發(fā)生血栓，當(dāng)脫落的栓子隨血液循環(huán)到達遠(yuǎn)端微小血管后，引起微小血管的梗死，加重腦缺血。謝道俊等[7]觀察60例血管性認(rèn)知障礙患者，結(jié)果顯示，高血壓是所有危險因素中最重要的因素，其次為高血脂、高血壓合并高血脂。KOVCS等[8]對72例嚴(yán)重高血壓患者的頸動脈內(nèi)膜厚度、動脈硬化程度和血管性認(rèn)知功能進行評估，結(jié)果顯示，合并有高膽固醇血癥的患者其頸動脈內(nèi)膜增厚，血管性認(rèn)知功能進一步惡化。本實驗中模型組大鼠亦出現(xiàn)了不同程度的認(rèn)知功能障礙(學(xué)習(xí)記憶能力下降)，與上述結(jié)果一致，提示血管性認(rèn)知功能障礙與高血壓、高血脂存在相關(guān)性。

海馬CA1區(qū)與學(xué)習(xí)認(rèn)知功能關(guān)系最為密切，對腦缺血具有高度敏感性，當(dāng)海馬區(qū)發(fā)生細(xì)胞凋亡時則出現(xiàn)認(rèn)知障礙，且認(rèn)知障礙的程度與凋亡程度相關(guān)[9]。在缺血性腦損傷中，bcl-2和bax是重要的凋亡調(diào)控基因[10]，bax為促凋亡蛋白，bcl則為抗凋亡蛋白，二者相互拮抗，當(dāng)bax蛋白表達過多，加速細(xì)胞凋亡，而bcl-2蛋白表達占優(yōu)勢時，則抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，模型組大鼠海馬組織bcl-2蛋白和bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多，表明bcl-2和bax都被激活，參與海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程。單純觀察bax或bcl-2蛋白的表達不能較好地體現(xiàn)其與凋亡的相關(guān)性，故常用bcl-2/bax比值判斷促進或抑制細(xì)胞凋亡[11]。

研究證實，永久性大腦中動脈阻塞后引起腦缺血和腦梗死的大鼠模型中，HGF可通過抑制細(xì)胞凋亡、促進神經(jīng)發(fā)生、軸突發(fā)生、血管新生發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12-13]。隨著基因治療技術(shù)的開展，目前Ad-HGF已廣泛應(yīng)用于臨床科研中，且取得良好的療效[14]。本實驗給予Ad-HGF藥物干預(yù)后，觀察到大鼠海馬區(qū)bax蛋白表達減弱，bcl-2蛋白表達增強，bcl-2/bax增高。表明Ad-HGF可能通過抑制海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡改善大鼠的認(rèn)知能力。本研究為后期評估Ad-HGF的安全性提供實驗數(shù)據(jù)及參考依據(jù)。認(rèn)知功能障礙和細(xì)胞凋亡是長期慢性過程，本實驗未對Ad-HGF劑量梯度和時間梯度進行監(jiān)測，且樣本量偏小，有待以后進一步完善。

[1] YING H，JIANPING C，JIANQING Y，etal.Cognitive variations among vascular dementia subtypes caused by small-，large-，or mixed-vessel disease[J].ArchMedSci，2016，12(4)：747-753.

[2] MORIGUCHI S，YABUKI Y，F(xiàn)UKUNAGA K.Reduced calcium/calmodulin-dependent protein kinase II activity in the hippocampus is associated with impaired cognitive function in MPTP-treated mice[J].JNeurochem，2012，120(4)：541-551.

[3] ZHANG L，HIMI T，MORITA I，etal.Hepatocyte growth factor protects cultured rat cerebellar granule neurons from apoptosis via the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway[J].JNeurosciRes，2000，59(4)：489-496.

[4] 朱巖巖.高血壓合并高血脂建立腦動脈粥樣硬化大鼠模型的實驗研究[J].中華腦科疾病與康復(fù)雜志：電子版，2014，4(2)：31-34.DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-123X.2014.02.008.

[5] HU Y，SUN B，LIU K，etal.Icariinattenuates high-cholesterol diet induced atherosclerosis in rats by inhibition of inflammatory response and p38 MAPK signaling pathway[J].Inflammation，2016，39(1)：228-236.

[6] 張羽喬，周俊山，張穎冬，等.不同程度頸動脈狹窄對大鼠認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國腦血管病雜志，2016，13(10)：529-534，557.

[7] 謝道俊，靳偉，韋彪.血管性認(rèn)知功能障礙的血管性危險因素及影像學(xué)研究[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24(3)：198-200.

[9] DUAN W，CHUN-QING Z，ZHENG J，etal.Relief of carotid stenosis improves impaired cognition in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion[J].ActaNeurobiolExp(Wars)，2011，71(2)：233-243.

[10] ZHAO H，YENARI M A，CHENG D，etal.Bcl-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome c translocation and caspase-3 activity[J].JNeurochem，2003，85(4)：1026-1036.

[11] 朱潔，馬茜，王辛，等.肌肽對局灶性腦缺血大鼠bcl-2、bax表達的影響[J].天津醫(yī)藥，2015，43(3)：259-262.

[12] TSUZUKI N，MIYAZAWA T，MATSUMOTO K，etal.Hepatocyte growth factor reduces infarct volume after transient focal cerebral ischemia in rats[J].NeurolRes，2001，23(4)：417-424.

[13] SHANG J，DEGUCHI K，OHTA Y，etal.Strong neurogenesis，angiogenesis，synaptogenesis，and antifibrosis of hepatocyte growth factor in rats brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].JNeurosciRes，2011，89(1)：86-95.

[14] YANG Z J，ZHANG Y R，CHEN B，etal.Phase I clinical trial on intracoronary administration of Ad-hHGF treating severe coronary artery disease[J].MolBiolRep，2009，36(6)：1323-1329.