以埃羅替尼為靶向基團的熒光探針在肺癌檢測中的應用

周淑敏，宋艷芳，千新來，魏家彬

(1.周口市中心醫(yī)院病理科，河南 周口 460000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肺癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢[1]。目前，肺癌的早期診斷主要依靠影像學和病理學檢查等，前者假陽性和假陰性率較高，且檢查費用昂貴，而后者具有創(chuàng)傷性[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是受體酪氨酸激酶家族中的重要成員之一，與配體表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)結(jié)合并發(fā)生二聚化后，胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，通過酪氨酸殘基磷酸化等方式激活下游的信號通路，參與細胞的分化、生存、遷移、侵襲、黏附和損傷修復等過程[3-4]。埃羅替尼是小分子酪氨酸激酶抑制劑，屬于4-氨基喹唑啉類口服型抗腫瘤藥物，主要用于治療非小細胞肺癌等[5]。埃羅替尼與EGFR的酪氨酸激酶結(jié)合具有高度特異性和可逆性的特點。本研究擬以埃羅替尼為靶向基團，制備EGFR胞內(nèi)區(qū)的熒光探針，用于檢測EGFR高表達的肺癌等惡性腫瘤。

1 材料與方法

1.1細胞及分組肺癌A-549細胞和宮頸癌CaSki、SiHa、C33-A細胞購于中國醫(yī)學科學院細胞庫，其中將肺癌A-549細胞作為實驗組，宮頸癌CaSki、SiHa和C33-A細胞作為對照組。

1.2主要試劑鹽酸埃羅替尼購自濟南健豐化工有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自國藥集團化學試劑有限公司，胎牛血清購自杭州四季青有限公司，F(xiàn)12K培養(yǎng)基購自美國GIBIO公司，鏈霉素購自山東齊魯制藥有限公司，青霉素購自華北制藥股份有限公司。

1.3以埃羅替尼為靶向基團的熒光探針的制備將0.051 5 g (0.15 mmol)香豆素疊氮化合物(相對分子質(zhì)量為343.38)、0.059 0 g (0.15 mmol)埃羅替尼(相對分子質(zhì)量為393.44)和0.005 7 g(0.03 mmol)碘化亞銅(相對分子質(zhì)量為190.45)加入到10 mL水-四氫呋喃溶液(四氫呋喃水=11)中，氮氣保護下，45 ℃下攪拌反應24 h。減壓蒸餾除去四氫呋喃，析出固體，過濾，過柱提純。將二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷甲醇=301)作為展開劑。產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為736.82。

1.4細胞培養(yǎng)及處理方法肺癌A-549細胞和宮頸癌CaSki、SiHa和C33-A細胞用含有體積分數(shù)10%胎牛血清、10萬U·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的F12K培養(yǎng)基或達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的孵箱中培養(yǎng)細胞。取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化后，將細胞加入含完全培養(yǎng)基的12孔板，于37 ℃，體積分數(shù)5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。

1.5細胞熒光成像(1)探針母液的配制：將0.007 4 g探針分子(0.01 mmol，相對分子質(zhì)量為736.82)溶解于10 mL DMSO，配制成1×10-3mol·L-1的溶液。(2)細胞熒光成像：取培養(yǎng)的細胞，于培養(yǎng)基中加入小于培養(yǎng)液體積1%的探針母液(加入量)，探針終濃度為0.1×10-6、1×10-6、10×10-6mol·L-1，分別應用此3個不同濃度的熒光探針對肺癌A-549細胞和CaSki、C33A、SiHa細胞進行熒光識別，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并照相。

2 結(jié)果

2.12組細胞在10×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布的比較結(jié)果見圖1。A-549細胞和CaSki細胞中均觀察到強熒光信號，而C33A和SiHa細胞中幾乎觀察不到熒光信號。

A：肺癌A-549細胞；B：肺癌A-549細胞對應的明場；C：宮頸癌CaSki細胞；D：宮頸癌CaSki細胞對應的明場；E：C33A細胞；F：C33A細胞對應的明場；G：SiHa細胞；H：SiHa細胞對應的明場。

圖12組細胞在10×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布的比較

Fig.1Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof10×10-6mol·L-1probe

2.22組細胞在1×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布比較結(jié)果見圖2。A-549細胞中可觀察到強的熒光信號，C33A中可觀察到較弱的熒光信號，而CaSki和SiHa細胞中幾乎觀察不到熒光信號。

A：肺癌A-549細胞；B：肺癌A-549細胞對應的明場；C：宮頸癌CaSki細胞；D：宮頸癌CaSki細胞對應的明場；E：C33A細胞；F：C33A細胞對應的明場；G：SiHa細胞；H：SiHa細胞對應的明場。

圖22組細胞在1×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布的比較

Fig.2Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof1×10-6mol·L-1probe

2.32組細胞在0.1×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布比較結(jié)果見圖3。A-549細胞中可觀察到強的熒光信號，而CaSki、C33A和SiHa細胞中幾乎不能觀察到熒光信號。

A：肺癌A-549細胞；B：肺癌A-549細胞對應的明場；B：宮頸癌CaSki細胞；D：宮頸癌CaSki細胞對應的明場；E：C33A細胞；F：C33A細胞對應的明場；G：SiHa細胞；H：SiHa細胞對應的明場。

圖32組細胞在0.1×10-6mol·L-1探針作用后細胞內(nèi)熒光信號強弱分布的比較

Fig.3Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof0.1×10-6mol·L-1probe

3 討論

EGFR作為抗腫瘤藥物的靶點，是由原癌基因CerbB編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，抑制EGFR的表達和(或)活性，阻斷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，可抑制腫瘤細胞增殖和新生血管的形成，但對正常細胞影響較小[6-7]。

臨床上以EGFR為靶點的治療策略主要包括2種：(1)針對 EGFR表面的配體結(jié)合位點的特異性單克隆抗體，通過作用于EGFR的胞膜外配體結(jié)合區(qū)，從而競爭性抑制EGFR與其配體EGF的結(jié)合，阻斷受體活化和相應的信號轉(zhuǎn)導通路，抑制腫瘤細胞的生長；(2)小分子酪氨酸激酶抑制劑，以埃羅替尼為代表的4-氨基喹唑啉類化合物臨床應用效果較好，其主要是通過抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性而發(fā)揮作用，即小分子酪氨酸激酶抑制劑可直接作用于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的三磷腺苷結(jié)合位點，干擾酪氨酸激酶與三磷腺苷的結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶的活性，抑制酪氨酸的自磷酸化，由此阻斷EGFR的信號轉(zhuǎn)導通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖以及新生血管的生成[8]。

埃羅替尼是小分子酪氨酸激酶抑制劑，其與EGFR的酪氨酸激酶結(jié)合具有高度特異性和可逆性的特點[9-12]。埃羅替尼口服吸收較慢但效果較好，口服給藥150 mg后達到峰值的平均時間為3 h，最高血藥濃度約為(1.136±0.865)×10-3g·L-1，生物利用度約為80%，血漿蛋白結(jié)合率約為90%～95%[13]。

肺癌的早期診斷日益受到重視，EGFR在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達狀態(tài)，如肺癌、胃癌、頭頸部腫瘤等，EGFR突變狀況可為臨床提供及時、準確的靶向治療，而鹽酸埃羅替尼作為胞內(nèi)區(qū)的腫瘤靶向藥物，可特異性的與EGFR結(jié)合。本研究以埃羅替尼為靶向基團，制備EGFR胞內(nèi)區(qū)的熒光探針，用于檢測EGFR高表達的肺癌等惡性腫瘤。

本研究分別用10×10-6、1×10-6、0.1×10-6mol·L-1的以埃羅替尼為靶向基團的熒光探針對肺癌A-549細胞和宮頸癌CaSki、SiHa、C33-A細胞進行熒光識別，當探針濃度為10×10-6mol·L-1時，A-549細胞和CaSki細胞中均觀察到強的熒光信號；當探針濃度為1×10-6mol·L-1時，A-549細胞中仍可觀察到強的熒光信號，C33A中可觀察到較弱的熒光信號，而CaSki和SiHa細胞中幾乎觀察不到熒光信號。為了避免實驗出現(xiàn)的弱熒光產(chǎn)生假陽性判斷，本研究用更低濃度0.1×10-6mol·L-1的探針來與細胞共孵育，觀測C33A細胞是否能被探針分子識別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A-549細胞中仍可觀察到強的熒光信號，而CaSki、C33A和SiHa細胞中幾乎觀察不到熒光信號。

綜上所述，以埃羅替尼為靶向基團的熒光探針可用于檢測A-549細胞，但是本研究只是初步的結(jié)果，該結(jié)果是否能夠用于臨床尚需進一步研究來證實。

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