鎂鈣合金浸提液對(duì)人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3表達(dá)的影響

王戰(zhàn)會(huì)，孫高斌，孫宗斌，張兵兵，鄭秋霞，劉少朋，段廷賀

(1.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院普外科，河南 洛陽 471000；2.解放軍150醫(yī)院普外科，河南 洛陽 471003)

在可降解鎂合金的研究中，生物材料和細(xì)胞的相互作用是一個(gè)需要重點(diǎn)考慮的問題。關(guān)于這方面的研究已有許多報(bào)道，如生物材料與細(xì)胞活性的關(guān)系、生物材料與細(xì)胞分化的關(guān)系等[1]。在細(xì)胞和鎂合金相互作用的實(shí)驗(yàn)研究中所用的細(xì)胞有人骨髓間質(zhì)細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞L-929和MG63，而關(guān)于鎂合金與腸上皮細(xì)胞相互作用的研究尚未見報(bào)道?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。MMP是一個(gè)大家族，因其需要鈣、鋅等金屬離子作為輔助因子而得名。其中MMP9是MMP家族中較為重要的一類[2]。MMP抑制劑主要是內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)，其中最主要的是TIMP3，其可結(jié)合MMP的活性位點(diǎn)，阻止膠原底物的進(jìn)入[3]。人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460被廣泛用于研究腸上皮細(xì)胞行為的模型。鎂合金在胃腸吻合中可用作吻合釘和外科縫合材料[4]。本研究選用鎂鈣合金來評(píng)價(jià)鎂合金對(duì)人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞MMP9及TIMP3的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460由解放軍150醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，保存于-80 ℃低溫冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)給予復(fù)蘇。

1.2主要試劑和儀器甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Boster公司，兔抗-MMP9購自美國Santa Cruz公司，兔抗-TIMP3購自美國Bioss公司，SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、Prime-Script?RT試劑盒、引物設(shè)計(jì)購自日本Takara公司，底物增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒、高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM) 購自上海碧云天生物科技有限公司，PTC-200 Peltier Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polyme-rase chainreaction，PCR)儀購自美國伯樂公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司，超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備公司，LightCycler儀購自瑞士羅氏公司，KL05R離心機(jī)購自湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司，蛋白核酸測定儀購自德國Eppendorf 公司。

1.3鎂鈣合金浸提液的制備醫(yī)療級(jí)純度鎂鈣合金由北京大學(xué)工學(xué)院提供，加工成直徑11.3 mm、厚2.0 mm的圓片狀，在碳化硅砂紙上磨平并拋光后，用無水乙醇超聲清洗，環(huán)氧乙烷消毒后，根據(jù)ISO 10993制備鎂鈣合金浸提液[5]，按每1.25 cm2的鎂鈣合金表面積使用1 mL DMEM高糖培養(yǎng)基的比例將鎂鈣合金圓片浸沒在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中放置24 h，1 000 r·min-1離心10 min，用50 mL注射器吸取上清液，保存于4 ℃冰箱中備用，在3 d內(nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。為了觀測劑量-效應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)時(shí)將上清液用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成體積分?jǐn)?shù)100%、50%和10%的鎂鈣合金浸提液。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NCM460細(xì)胞中MMP9和TIMP3mRNA的表達(dá)制備NCM460細(xì)胞懸液，將5×106L-1的細(xì)胞懸液加入24孔板中，每孔1 000 μL，分為空白對(duì)照組及加入不同濃度鎂鈣合金浸提液的實(shí)驗(yàn)1、2、3組，每組用1個(gè)24孔板，空白對(duì)照組每孔加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基2 000 μL，實(shí)驗(yàn)1、2、3組每孔分別加入體積分?jǐn)?shù)10%、50%及100%的鎂鈣合金浸提液2 000 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、3、5 d，然后，TRIzol法提取總RNA，用蛋白核酸測定儀檢測總RNA的濃度及吸光度(A260/A280)值。各基因引物序列由大連Takara生物有限公司設(shè)計(jì)與合成，MMP9上游引物為5′-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3′，下游引物為5′-CCTGTGTACACCCACACCTG-3′；TIMP3上游引物為5′-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3′，下游引物為5′-CCCCCCAAA-AACCCCACCTCA-3′；GAPDH上游引物為5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGT-3′，下游引物為5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3′。在PTC-200 Peltier Thermal Cycler PCR儀上運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在LightCycler儀上運(yùn)用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增條件為：第1個(gè)循環(huán)為95 ℃預(yù)變性30 s，接著行40個(gè)PCR循環(huán)：95 ℃變性5 s，62 ℃延伸20 s。隨后在95 ℃和65 ℃之間進(jìn)行融解曲線分析，結(jié)果分析采用2-△△CT(Livak法)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5免疫印跡法檢測NCM460細(xì)胞中MMP9和TIMP3蛋白表達(dá)制備NCM460細(xì)胞懸液，將5×106L-1的細(xì)胞懸液加入24孔板中，每孔1 000 μL，分為空白對(duì)照組及加入不同濃度鎂鈣合金浸提液的實(shí)驗(yàn)1、2、3組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組用1個(gè)24孔板，空白對(duì)照組每孔加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基2 000 μL，實(shí)驗(yàn)1、2、3組每孔分別加入體積分?jǐn)?shù)10%、50%及100%的鎂鈣合金浸提液2 000 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)5 d，加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶1 mL消化1～2 min，分別消化各組細(xì)胞，加蛋白裂解液，冰上裂解20 min，12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，測定蛋白濃度，蛋白上清液經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，恒壓轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含50 g·L-1羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris buffered saline tween，TBST)封閉2 h，一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，然后與ECL底物孵育5 min，以GAPDH為內(nèi)參照，在暗室中X線片顯影，圖像掃描。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1各組NCM460細(xì)胞中MMP9mRNA表達(dá)比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)1 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)3、5 d后，實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平仍顯著低于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平顯著高于實(shí)驗(yàn)2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)3、5 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著高于培養(yǎng)1 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平與培養(yǎng) 3 d 后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著高于培養(yǎng)3 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1各組NCM460細(xì)胞中MMP9mRNA表達(dá)水平

組別nMMP9mRNA培養(yǎng)1d培養(yǎng)3d培養(yǎng)5d空白對(duì)照組31.000±0.031 1.000±0.053 1.000±0.028 實(shí)驗(yàn)1組30.057±0.003a0.575±0.044ad0.680±0.031ad實(shí)驗(yàn)2組30.063±0.010a3.161±0.136abd10.612±0.427abde實(shí)驗(yàn)3組30.641±0.052abc4.514±0.179abd16.159±0.843abcde

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較cP<0.05；與1 d時(shí)比較dP<0.05；與3 d時(shí)比較eP<0.05。

2.2各組NCM460細(xì)胞中TIMP3mRNA表達(dá)水平比較結(jié)果見表2。培養(yǎng)1 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)3 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于空白組，實(shí)驗(yàn)2組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著低于實(shí)驗(yàn)1、3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞中培養(yǎng)3、5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于培養(yǎng)1 d后，培養(yǎng)5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)3 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)2組NCM460細(xì)胞中培養(yǎng)3 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著低于培養(yǎng)1 d后，培養(yǎng)5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)1、3 d后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)3組NCM460細(xì)胞中培養(yǎng)5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)1、3 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2各組NCM460細(xì)胞中TIMP3mRNA表達(dá)水平

組別nTIMP3mRNA培養(yǎng)1d培養(yǎng)3d培養(yǎng)5d空白對(duì)照組31.000±0.025 1.000±0.049 1.000±0.003 實(shí)驗(yàn)1組30.265±0.048a0.502±0.040ad6.759±0.785ade實(shí)驗(yàn)2組30.471±0.009ab0.202±0.068abd5.147±0.885ade實(shí)驗(yàn)3組30.526±0.061ab0.454±0.031ac6.065±0.151ade

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較cP<0.05；與1 d時(shí)比較dP<0.05；與3 d時(shí)比較eP<0.05。

2.3培養(yǎng)5d后各組NCM460細(xì)胞中MMP9和TIMP3蛋白表達(dá)結(jié)果見表3及圖1。培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)3組NCM460細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3培養(yǎng)5d后4組NCM460細(xì)胞中MMP9、TIMP3蛋白表達(dá)比較

組別nMMP9蛋白TIMP3蛋白空白對(duì)照組31.025±0.3711.062±0.105實(shí)驗(yàn)1組30.854±0.1342.665±0.064a實(shí)驗(yàn)2組32.719±0.235ab2.866±0.077a實(shí)驗(yàn)3組33.317±0.247ab3.367±0.116a

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較cP<0.05。

A：空白對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)1組；C：實(shí)驗(yàn)2組；D：實(shí)驗(yàn)3組。

圖1各組NCM460細(xì)胞中MMP9及TIMP3蛋白的表達(dá)

Fig.1ExpressionoftheMMP9andTIMP3proteininNCM460cellsineachgroup

3 討論

與鎂鈣合金相比，目前臨床上普遍采用的鈦合金具有質(zhì)量輕、彈性模量更加接近正常骨組織、避免應(yīng)力遮擋等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有無磁性、可加工性強(qiáng)等特點(diǎn)，是具有臨床應(yīng)用前景的一種新型金屬材料。一種新的生物材料在進(jìn)入臨床之前必須進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)，完整的生物學(xué)評(píng)價(jià)包括初級(jí)急性毒性篩選、動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用和臨床試用3級(jí)試驗(yàn)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是初級(jí)急性毒性篩選的一個(gè)重要方面。MMP是一種Zn2+和Ca2+依賴性的中性蛋白酶家族，其主要功能是降解和再塑造細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，參與人體許多病理和生理過程[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的MMP有20種以上，其中MMP9因其作用底物的廣泛、表達(dá)細(xì)胞眾多而備受重視，成為國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)之一[6]。MMP9又稱明膠酶B，它是一種肝細(xì)胞合成的非特異性急性時(shí)相蛋白，在正常人體中含量極微，但在鎂合金血管支架置入早期感染的急性炎癥反應(yīng)階段，其含量在6 h內(nèi)迅速增加，于24～48 h達(dá)到峰值，由于MMP9的半衰期<24 h，故在控制感染后其會(huì)快速降至正常。因此，MMP9可以作為評(píng)價(jià)鎂合金血管支架置入早期炎癥反應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)[7]。體內(nèi)MMP9所起的作用可被TIMP阻斷[8]。TIMP由多基因家族成員組成，其能與MMP的催化區(qū)以11可逆性結(jié)合，抑制MMP的活性。TIMP主要由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞合成分泌，在體內(nèi)分布廣泛，目前報(bào)道的共有4種：TIMP-1、2、3和4，其中TIMP3是與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的非可溶性蛋白，位于細(xì)胞外膜上[9]。MMP9和TIMP3的表達(dá)變化是測定生物材料的生物相容性時(shí)需要考慮的重要因素。本研究分析了與細(xì)胞應(yīng)答密切相關(guān)的MMP9和TIMP3的表達(dá)，以更深入地了解可降解鎂合金對(duì)腸上皮細(xì)胞的影響。NCM460細(xì)胞系作為一種有效的細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于腸道植入材料生物相容性評(píng)價(jià)的體外實(shí)驗(yàn)。因此，本研究采用NCM460細(xì)胞為模型來評(píng)價(jià)鎂合金作為腸道植入材料的可行性，所用的鎂合金為鎂鈣合金，通過研究不同濃度鎂鈣合金浸提液對(duì)人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460中的MMP9及TIMP3表達(dá)的影響，來研究鎂鈣合金的生物相容性。

本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)1 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組(體積分?jǐn)?shù)10%、50%、100%浸提液組)NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組，培養(yǎng)3、5 d后，實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平仍顯著低于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組；培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平顯著高于實(shí)驗(yàn)2組。培養(yǎng)3、5 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯著高于培養(yǎng)1 d后；培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)2、3組NCM460細(xì)胞中MMP9 mRNA表達(dá)水平均顯均高于培養(yǎng)3 d后。本研究結(jié)果顯示，隨著浸提液濃度的增高，MMP9 mRNA表達(dá)水平具有增高趨勢，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，MMP9 mRNA表達(dá)水平亦具有增高趨勢，提示高濃度的鎂鈣合金浸提液容易導(dǎo)致早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生。王汝朋等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，鎂合金血管支架植入后不同時(shí)間點(diǎn)冠狀動(dòng)脈局部MMP9陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；與支架植入 24 h、3 d、5 d、1周比較，植入1個(gè)月后冠狀動(dòng)脈局部MMP9陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示可吸收鎂合金支架植入后的組織炎癥程度輕，持續(xù)時(shí)間短。趙然尊等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，支架置入治療組患者術(shù)前MMP9水平均高于對(duì)照組，且隨訪時(shí)再狹窄組患者M(jìn)MP9水平與非再狹窄組患者比較均明顯升高，提示二者可能參與血管成形后再狹窄的發(fā)生。王汝朋等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MMP9峰值出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間可以評(píng)價(jià)鎂合金支架置入后早期炎癥反應(yīng)的情況。上述研究與本研究結(jié)果基本一致，鎂合金均能引起炎癥反應(yīng)，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，鎂鈣合金有一個(gè)逐漸降解的過程，因而，由其引起的早期炎癥反應(yīng)是比較輕微的。MMP9在高濃度鎂鈣合金浸提液培養(yǎng)過的細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制仍不清楚，可能與浸提液中的鈣離子濃度有關(guān)。MMP是一組Zn2+和Ca2+依賴的內(nèi)肽酶，它們大小各異，底物不盡相同，但均含有信號(hào)肽、前肽、催化區(qū)和C末端4個(gè)結(jié)構(gòu)域，催化區(qū)有2個(gè)Zn2+結(jié)合區(qū)和至少1個(gè)Ca2+結(jié)合區(qū)[12]。高濃度鎂鈣合金浸提液中的Ca2+可能會(huì)激活MMP9的高表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于實(shí)驗(yàn)1、3組；培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組NCM460細(xì)胞中TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)1組NCM460細(xì)胞培養(yǎng)3、5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于培養(yǎng)1 d后，培養(yǎng)5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)3 d后；實(shí)驗(yàn)2組NCM460細(xì)胞培養(yǎng) 3 d 后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著低于培養(yǎng)1 d后，培養(yǎng) 5 d 后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)3 d后；實(shí)驗(yàn)3組NCM460細(xì)胞培養(yǎng)5 d后的TIMP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于培養(yǎng)1、3 d后。本研究結(jié)果提示，隨著浸提液濃度的增高，TIMP3 mRNA表達(dá)水平具有增高趨勢，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，TIMP3 mRNA表達(dá)水平亦具有增高趨勢。導(dǎo)致TIMP3在高濃度鎂鈣合金浸提液處理過的細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制仍不清楚，考慮可能與浸提液中的鈣離子濃度有關(guān)，鈣離子濃度增加導(dǎo)致MMP增加，從而進(jìn)一步導(dǎo)致TIMP3的反應(yīng)性增加。

綜上所述，高濃度的鎂鈣合金浸提液對(duì)NCM460細(xì)胞中的MMP9及TIMP3基因表達(dá)有一定影響，容易導(dǎo)致早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其機(jī)制可能與浸提液中的鈣離子濃度有關(guān)。但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，鎂鈣合金的降解是一個(gè)逐漸的過程，鈣離子的釋放會(huì)比較緩慢，由其引起的早期炎癥反應(yīng)是比較輕微的。

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