乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因狀態(tài)與HER2及臨床病理特征的關(guān)系

趙麗輝，易冰，孟鳳嬌

（中山市人民醫(yī)院1.分子診斷中心，2.病理科，廣東 中山528403）

乳腺癌發(fā)病率以每年5%的速度增長，且呈年輕化、低齡化[1－3]。目前乳腺癌的治療除手術(shù)外，還包括激素治療、化療和靶向治療；蒽環(huán)類藥物在化療方案中具有重要作用，但有效率僅為25% ～30%[4－5]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡalpha，TOP2A）是常見的化療療效預(yù)測(cè)因子，其擴(kuò)增或缺失與蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性之間具有相關(guān)性[6－7]。研究發(fā)現(xiàn)[8]，蒽環(huán)類藥物作用于TOP2a蛋白，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但同時(shí)具有嚴(yán)重的毒副作用。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因，也是臨床預(yù)后重要的指標(biāo)之一，其與TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)具有一定相關(guān)性[9]。有分析指出，TOP2A基因擴(kuò)增時(shí)不伴HER2基因擴(kuò)增極為罕見。研究表明，當(dāng)不存在HER2/neu型基因時(shí)，很大一部分乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)TOP2A基因擴(kuò)增或過表達(dá)[10－11]。因此，本文擬通過熒光原位雜交法（FISH）檢測(cè)371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因，分析其基因狀態(tài)與HER2基因、HER2蛋白表達(dá)及臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

篩選收集2015年7月至2017年5月于中山市人民醫(yī)院乳腺外科就診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者371例。其中，男3例，女368例；年齡25～86歲，≥50歲191例，＜50歲180例；乳腺手術(shù)切除116例，B超引導(dǎo)下乳腺腫塊穿刺活檢255例；左乳190例，右乳181例。

所有患者手術(shù)及穿刺前均未行放療、化療或分子靶向治療。手術(shù)及穿刺標(biāo)本均按常規(guī)行10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，由病理科醫(yī)師閱片確診為浸潤性導(dǎo)管癌。本研究所涉及的相關(guān)病理檢測(cè)均獲得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器

FISH檢測(cè)GLP TOP2A/GSP 17探針試劑盒購自廣州安必平生物技術(shù)有限公司；ThermoBrite S500-24熒光原位雜交儀（美國Abbott公司）；BX51熒光顯微鏡，JENOPTIK攝像頭及FISH分析軟件（日本Olympus公司）。雙色銀染原位雜交法（DISH）檢測(cè)試劑包括Inform HER-2/CEP17 DNA雙探針、Ultra-View SISH DNP檢測(cè)試劑盒、UltraViewRed ISH DIG檢測(cè)試劑盒以及輔助試劑均為瑞士羅氏Ventana公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀（瑞士羅氏Ventana公司）。

1.3 方法

1.3.1 FISH檢測(cè)TOP2A基因狀態(tài) 3～4μm連續(xù)石蠟切片，貼至涂膠片上，65℃恒溫箱烤片過夜；二甲苯脫蠟2次，每次15 min；無水乙醇脫蠟10 min；梯度乙醇（100%、95%、80%、70%）脫水各 3 min至去離子水；100℃煮片25 min；晾干后胃蛋白酶37℃恒溫消化3～10 min；2×SSC緩沖液洗片2次，每次5 min；梯度乙醇（70%、80%、95%、100%）脫水各3 min，自然晾干；滴加TOP2A雜交液，封片，在雜交儀上變性雜交10～18 h，2×SSC與0.1%NP-40洗液洗去多余雜交液；滴加DAPI復(fù)染劑于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。檢測(cè)前需通過HE染色切片定位腫瘤浸潤區(qū)域。

1.3.2 DISH檢測(cè)HER2基因狀態(tài) 3～4μm石蠟切片，65℃恒溫箱烤片1～2 h，置于BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，放入DISH檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)，具體按操作試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)束后取片，用含清潔劑的清水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以腫瘤周邊的間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他非腫瘤細(xì)胞作為自身內(nèi)對(duì)照。

1.3.3 IHC檢測(cè) HER2蛋白表達(dá) 2～3μm石蠟切片，65℃恒溫箱烤片1～2 h，將切片置于Bench-Mark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，放入DAB試劑盒、蘇木素、返藍(lán)液，一抗為 HER2/NEU（4B5）單克隆抗體，具體操作步驟嚴(yán)格按羅氏診斷優(yōu)化程序執(zhí)行。結(jié)束后取片，用含清潔劑的清水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陰性對(duì)照為同一切片中正常導(dǎo)管上皮，陽性對(duì)照選取HER2（2＋）并經(jīng)FISH檢測(cè)證實(shí)的乳腺癌病例。

1.3.4 結(jié)果判讀 FISH結(jié)果判讀的具體方法參照文獻(xiàn)[12－13]；DISH檢測(cè)結(jié)果判讀參照2013年ASCO/CAPHER2指南[13]；IHC：參照乳腺癌 HER2檢測(cè)指南（2014版），均以浸潤癌細(xì)胞為觀察目標(biāo)，無著色或≤10%癌細(xì)胞微弱膜著色為（0）；≥10%癌細(xì)胞微弱膜著色為（1＋）；10%癌細(xì)胞不完整和（或）中等強(qiáng)度膜著色，或≤10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為（2＋）；＞10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為（3＋）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各變量之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A基因狀態(tài)與HER2的相關(guān)性

由表1可見，371例患者中TOP2A基因擴(kuò)增64例，缺失 12例，總異常率為 20.49%（76/371），無擴(kuò)增或缺失295例；HER2基因擴(kuò)增122例（32.88%，122/371），高于TOP2A基因擴(kuò)增；TOP2A基因與HER2基因共擴(kuò)增53例；12例TOP2A基因缺失中有9例HER2基因擴(kuò)增，295例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失中有60例HER2基因擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)分析顯示，TOP2A基因狀態(tài)與HER2基因明顯相關(guān)（P＜0.05）。TOP2A基因擴(kuò)增率隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高（P＜0.05），TOP2A基因狀態(tài)與HER2蛋白表達(dá)明顯相關(guān)（P＜0.05）。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因TOP2A和HER2基因狀態(tài)及 HER2蛋白表達(dá)見圖1。

表1 TOP2A基因與HER2基因及HER2蛋白表達(dá)的關(guān)系 例（%）

圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因狀態(tài)及蛋白表達(dá)

2.2 TOP2A基因異常與臨床病理特征的關(guān)系

由表2可見，TOP2A基因狀態(tài)與年齡、部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P＞0.05）；男性異常率高于女性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅰ級(jí)異常率最低（3.03%），Ⅲ級(jí)異常率最高（30.91%），TOP2A基因狀態(tài)與病理組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P＜0.05）；TOP2A基因異常中伴有高級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例高于伴中、低級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤直徑為 2～5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高，腫瘤直徑與TOP2A基因狀態(tài)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

TOP2A基因是核基質(zhì)成分之一，在核內(nèi)發(fā)揮作用[14]。TOP2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化、控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，且在增殖細(xì)胞中呈周期性特異表達(dá)。TOP2A在腫瘤細(xì)胞的不同周期表達(dá)各異，一般表現(xiàn)為在DNA復(fù)制后期及有絲分裂期表達(dá)增加，有絲分裂期結(jié)束后表達(dá)有所下降，提示腫瘤增殖受TOP2A表達(dá)影響[15]。TOP2A基因參與乳腺癌細(xì)胞的復(fù)制，存在TOP2A基因異常的患者預(yù)后差，無復(fù)發(fā)生存期縮短，尤其是TOP2A基因缺失的患者預(yù)后更差。基因擴(kuò)增提示腫瘤有復(fù)發(fā)的可能，或者遠(yuǎn)期的療效下降。因此，正確檢測(cè)和評(píng)定乳腺癌中TOP2A狀態(tài)至關(guān)重要。

表2 TOP2A基因與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

TOP2A變異有兩種表現(xiàn)形式，分別是TOP2A基因拷貝數(shù)（判斷擴(kuò)增與否）和TOP2AmRNA表達(dá)。國外有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌TOP2A基因擴(kuò)增率為23.9%，基因缺失率為2.8%[16]；國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道TOP2A基因擴(kuò)增率為12.6%～19.0%，未見有缺失報(bào)道[17－19]。本研究顯示，371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因異常率為20.49%，其中擴(kuò)增率為17.25%（64/371），與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。TOP2A基因和HER2原癌基因均定位于染色體17q11.2-22，且二者相近。有研究表明[9]，HER2與 TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)存在一定相關(guān)性且共同影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展。明潔等[18]研究顯示，TOP2A擴(kuò)增及表達(dá)可能依賴于 HER2擴(kuò)增及表達(dá)；TOP2A與HER2呈共表達(dá)[20]，HER2蛋白過表達(dá)與基因擴(kuò)增存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，HER2基因擴(kuò)增（122例）高于 TOP2A基因擴(kuò)增（64例），TOP2A與HER2基因共擴(kuò)增53例，達(dá)82.81%，二者呈明顯相關(guān)，說明HER2基因表達(dá)可影響TOP2A基因表達(dá)。122例HER2基因擴(kuò)增中有60例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失，249例HER2無擴(kuò)增中有10例TOP2A基因擴(kuò)增，76例TOP2A基因擴(kuò)增和缺失中有13例HER2基因并無擴(kuò)增，這說明TOP2A與HER2基因雖具有相關(guān)性，但仍有各自獨(dú)立的因素存在。本研究中TOP2A基因擴(kuò)增隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高，TOP2A基因缺失在HER2蛋白表達(dá)為3＋時(shí)最高，說明HER2蛋白過表達(dá)不但與HER2基因擴(kuò)增相關(guān)，與TOP2A基因異常也存在一定的相關(guān)性。此外我們發(fā)現(xiàn)，TOP2A基因改變與患者年齡、性別和部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，男性乳腺癌異常率雖然高于女性，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于樣本例數(shù)較少，還有待于積累病例數(shù)進(jìn)一步明確。浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)越高，腫瘤細(xì)胞分化程度越差，TOP2A基因異常率就越高，而且腫瘤直徑為2～5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高。此外，76例TOP2A基因異常的浸潤性導(dǎo)管癌中有16例伴有不同分化程度的原位癌，以高級(jí)別原位癌為主，這可能是腫瘤在從原位癌發(fā)展為浸潤癌的過程中細(xì)胞增殖比較活躍導(dǎo)致異常率增高的原因。

TOP2A是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，TOP2A基因擴(kuò)增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及藥效[21－22]，而HER2狀態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物的化療效果尚無定論。有研究報(bào)道[19]，TOP2A可能比HER2對(duì)蒽環(huán)類藥物更有預(yù)測(cè)作用。因此，臨床在使用蒽環(huán)類藥物治療時(shí)，應(yīng)分別進(jìn)行TOP2A及HER2基因檢測(cè)，尤其是對(duì)HER2蛋白高表達(dá)、腫瘤組織分級(jí)高的患者。

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因、HER2基因及蛋白的表達(dá)存在復(fù)雜性，但已成為乳腺癌治療和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)，TOP2A基因檢測(cè)可能是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌蒽環(huán)類藥物使用的重要依據(jù)。

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