分化抑制因子1基因在急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞中的表達

姚欣妤，周靜東，張婷娟，林江，張巍，錢軍

（1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液內科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）是一種細胞遺傳學和分子生物學異質性較大的惡性克隆性疾病，其特征在于造血干細胞分化阻滯和成熟障礙，導致大量異常細胞即白血病細胞積累繼而導致造血功能衰竭[1]。目前已經證實細胞遺傳異常和基因突變不僅與疾病發(fā)生有關，而且對于疾病預后判斷也很重要[2－3]。除遺傳學改變之外，基因表達異常也是AML中常見的分子事件，并且可能與疾病的預后密切相關[3]。

分化抑制因子（inhibitor of differentiation，ID）家族基因編碼螺旋—環(huán)—螺旋（helix-loop-helix，HLH）蛋白，對促進細胞分化的堿性HLH轉錄因子起負調控作用[4]。ID1是ID基因的家族一員，已經被鑒定為潛在的原癌基因，在細胞增殖以及侵襲中起作用，并保護細胞免受藥物誘導的凋亡[4]。多種實體瘤中ID1呈現(xiàn)過表達，并且與預后相關[4]。有少量研究涉及AML患者中ID1呈現(xiàn)過表達趨勢，但其臨床意義不盡相同[5－6]，其過表達對AML患者預后的影響仍然存在爭議。因此，本研究旨在探討初發(fā)AML患者骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）中ID1表達的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

153例初診 AML患者均為2005年10月至2016年7月在江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液科治療案例。AML患者的具體臨床參數(shù)見表1。診斷分型按FAB和2008版WHO標準[7－8]。治療方案參照本課題組前期報道[9]。

1.2 BMMNCs分離、RNA提取和逆轉錄

所有AML患者行骨髓穿刺時抽取10 mL血，使用Ficoll密度梯度離心法分離 BMMNCs?？?RNA應用TRIzol（美國Invitrogen公司）提取，并逆轉錄為cDNA[10]。逆轉錄總反應體系為 40μL，含總 RNA（2μg）、隨機引物（4μL×10μmol/L，日本 TaKaRa公司）、M-MLV逆轉錄酶（200 U，美國Thermo Fisher Scientific公司）、dNTPs（4μL×10 mmol/L）和 RNA酶抑制劑（25 U，美國 Thermo Fisher Scientific公司）。逆轉錄反應條件為25℃10 min、42℃60 min。

1.3 實時熒光定量PCR檢測ID1表達

目的基因ID1引物序列為5′-CTCAGCACCCTCAACGG-3′（上游）、5′-GATCGGTCTTGTTCTCCCTC-3′（下游）；選取ABL為內參基因，引物序列為5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′（上 游）、5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′（下游），引物由上海華大基因科技有限公司合成。PCR反應體系共20μL，含10μL預染液（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，美國 Vazyme公司）、0.4μL ROX參比染料 1（美國Vazyme公司）、0.8μL上下游引物及20 ng cDNA。PCR反應在ABI 7300擴增儀（美國ABI公司）上進行，反應條件為95℃ 5 min（預變性）、95℃ 10 s（變性）、62℃ 30 s（退火）、72℃ 30 s（延伸）、80℃30 s（收集熒光），共35個循環(huán)；熔解曲線程序為95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s、60℃ 15 s。每次擴增反應均含陽性對照（重組ID1質粒）和陰性對照（雙蒸水）。ID1基因表達相對定量采用2－△△CT計算。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學處理。兩組連續(xù)性變量間的差異分析使用Mann-WhitneyU檢驗，分類變量之間的差異比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ID1表達與AML患者臨床參數(shù)的關系

ID1基因在AML患者中的表達范圍為0.000～3.536（中位為0.030）。以中位數(shù)值為界將AML患者分為高表達組和低表達組，兩組常見的臨床參數(shù)比較見表1。兩組患者性別、外周血小板計數(shù)以及常見基因突變間無明顯差異（P＞0.05），外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、FAB分型、WHO分型、核型分組及核型危險程度分組趨近統(tǒng)計學差異（P＜0.10）。然而，ID1高表達患者年齡以及骨髓原始細胞比例顯著高于ID1低表達患者（P＝0.033和0.035）。在 FAB、WHO分型及核型分組中，ID1高表達在 FAB-M3/WHO-t（15；17）中發(fā)生頻率較低（29%，10/34），而在剩余其他類型中發(fā)生頻率為56%（67/119），兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7.649，P＝0.007）。

2.2 ID1表達與AML患者預后的關系

2.2.1ID1表達與患者化療反應之間的關系 經1～2個療程誘導化療后，有隨訪資料患者131例，ID1高表達患者完全緩解率顯著低于ID1低表達患者（P＜0.01，表1）。同時，定量分析發(fā)現(xiàn)經1～2個療程誘導化療獲得完全緩解的AML患者初診時ID1表達水平顯著低于未獲得完全緩解的AML患者（U＝1408.0，P＝0.001，圖1）。

表1 ID1表達與AM L患者臨床參數(shù)的關系

續(xù)表1

圖1 獲得完全緩解以及未獲得完全緩解的AML患者初診時ID1表達

2.2.2ID1表達與患者總體生存時間的關系ID1高表達患者的總體生存時間明顯低于ID1低表達患者（中位生存時間分別為5個月和14個月，P＝0.002）。在非M3患者中，ID1高表達患者的總體生存時間也明顯低于ID1低表達患者（中位生存時間分別為4個月和8個月，P＝0.008）。在正常核型患者中，ID1高表達患者的總體生存時間亦有明顯的趨勢低于ID1低表達患者（中位生存時間分別為6個月和12個月，P＝0.050）。見圖2。

圖2 AM L患者ID1表達對總體生存時間的影響

3 討論

ID1過表達與大多數(shù)實體瘤的預后不良相關[4]，但是ID1過表達對AML患者預后的影響仍然存在爭議。Tang等[5]報道ID1高表達預示年齡＜60歲的非M3或者正常核型AML患者完全緩解率降低、總體生存時間和無白血病生存時間縮短。然而，Damm等[6]揭示ID1過表達不是正常核型AML患者的獨立預后因素，可能是與CEBPA野生型和（或）FLT3-ITD突變相關。我們前期的研究結果顯示，ID1過表達與CEBPA及FLT3-ITD等基因突變并無明顯相關，可能是由于這些基因突變的頻率在中國人群中較低[11－13]。這種差異最可能歸因于種族和AML亞型分布的差異[16]。本組資料的預后相關分析顯示，ID1高表達與AML患者較低的完全緩解率相關，提示ID1可能參與耐藥，進一步的生存分析證實了ID1高表達無論是在全部、非M3還是正常核型AML中都與預后不良密切相關。

此外，本研究還顯示ID1表達尤其是在t（15；17）/M3中的表達，與核型顯著相關。然而，如果M3患者被排除在分析之外，我們沒有觀察到ID1表達與核型分型之間的顯著相關性，這與國外的研究結果一致[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)急性早幼粒細胞白血?。碝3）患者原代白血病細胞以及NB4細胞系（M3細胞株）在全反式維甲酸治療誘導分化后，ID1表達上調，提示ID1是全反式維甲酸的反應基因[14]。此外，ID1過表達抑制增殖并導致NB4細胞中的G0/G1阻滯[15]。然而，后來的研究顯示，ID1過表達促進了原始骨髓祖細胞的增殖，ID1沉默抑制了白血病細胞株生長[16]。這些結果表明ID1在白血病發(fā)生過程中的作用可能取決于不同細胞遺傳學背景。

綜上所述，ID1基因表達水平可作為AML患者化療反應以及預后判斷的分子標志。

[1]Estey E，D?hner H.Acutemyeloid leukemia[J].Lancet，2006，368（9550）：1894－1907.

[2]Grimwade D，Mrózek K.Diagnostic and prognostic value of cytogenetics in acute myeloid leukemia[J].HematolOncol Clin North Am，2011，25（6）：1135－1161.

[3]Mrózek K，MarcucciG，Paschka P，etal.Clinical relevance ofmutations and gene-expression changes in adult acutemyeloid leukemiawith normal cytogenetics：arewe ready for a prognostically prioritizedmolecular classification？[J].Blood，2007，109（2）：431－448.

[4]Lasorella A，Benezra R，Iavarone A.The ID proteins：master regulators of cancer stem cells and tumour aggressiveness[J].Nat Rev Cancer，2014，14（2）：77－91.

[5]Tang R，Hirsch P，F(xiàn)ava F，et al.High Id1 expression is associated with poor prognosis in 237 patients with acute myeloid leukemia[J].Blood，2009，114（14）：2993－3000.

[6]Damm F，Wagner K，G rlich K，et al.ID1 expression associates with othermolecularmarkers and is notan independent prognostic factor in cytogenetically normal acutemyeloid leukemia[J].Br JHaematol，2012，158（2）：208－215.

[7]Bennett JM，Catovsky D，Daniel MT，et al.Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia.A report of the French-American-British Cooperative Group[J].Ann Intern Med，1985，103（4）：620－625.

[8]Vardiman JW，Thiele J，Arber DA，et al.The 2008 revision of the World Health Organization（WHO）classification ofmyeloid neoplasms and acute leukemia：rationale and important changes[J].Blood，2009，114（5）：937－951.

[9]Zhou JD，Zhang TJ，Li XX，et al.Epigenetic dysregulation of ID4 predicts disease progression and treatment outcome in myeloid malignancies[J].JCell Mol Med，2017，21（8）：1468－1481.

[10]楊海燕，周靜東，楊磊，等.急性髓系白血病患者BAALC的表達及其臨床意義[J].江蘇大學學報（醫(yī)學版），2015，25（2）：169－174.

[11]Wen XM，Lin J，Yang J，et al.Double CEBPA mutations are prognostically favorable in non-M3 acute myeloid leukemia patients with wild-type NPM1 and FLT3-ITD[J].Int JClin Exp Pathol，2014，7（10）：6832－6840.

[12]Lin J，Yao DM，Qian J，et al.Recurrent DNMT3A R882 mutations in Chinese patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome[J].PLoSOne，2011，6（10）：e26906.

[13]Lin J，Yao DM，Qian J，et al.IDH1 and IDH2 mutation analysis in Chinese patientswith acutemyeloid leukemia andmyelodysplastic syndrome[J].Ann Hematol，2012，91（4）：519－525.

[14]Su L，LiX，Gao SJ，etal.Cytogenetic and geneticmutation features of de novo acutemyeloid leukemia in elderly Chinese patients[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（2）：895－898.

[15]Nigten J， Breems-de Ridder MC， Erpelinck-Verschueren CA，et al.ID1 and ID2 are retinoic acid responsive genes and induce a G0/G1 accumulation in acute promyelocytic leukemia cells[J]. Leukemia，2005，19（5）：799－805.

[16]Suh HC，LeeanansaksiriW，JiM，et al.Id1 immortalizes hematopoietic progenitors in vitro and promotes amyeloproliferative disease in vivo[J].Oncogene，2008，27（42）：5612－5623.