肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床意義

楊卉，許文林，蘇兆亮，陳琦

（1.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院乳腺科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢(shì)[1－2]，早期診斷和治療可有效降低死亡率。目前，乳腺癌的疾病篩查和對(duì)重點(diǎn)人群的監(jiān)控主要基于血清學(xué)檢測(cè)，如CA153、CA125以及癌胚抗原，這些腫瘤標(biāo)志物的診斷敏感度和特異性都較低，限制了其在臨床診療過(guò)程中對(duì)原發(fā)性乳腺癌早期診斷的應(yīng)用價(jià)值[3]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者[4]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌篩查過(guò)程中，如果單獨(dú)使用某一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，敏感度不超過(guò)10%，而即使聯(lián)合多種標(biāo)志物來(lái)篩查，敏感度最多達(dá)20%左右。因此，尋求乳腺癌血清學(xué)篩查的新型標(biāo)志物成為研究的重點(diǎn)[5]。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿miRNAs作為乳腺癌診斷標(biāo)志物顯示出比傳統(tǒng)標(biāo)志物更高的臨床應(yīng)用價(jià)值[6－8]。Huang等[9]用 RNA深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外泌體中存在一些長(zhǎng)鏈非編碼（long chain noncoding，lnc）RNA，直接證實(shí)了外周血中存在 lncRNA。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳腺癌患者血液中循環(huán)核酸是由癌細(xì)胞凋亡或壞死而釋放的[10－11]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）是長(zhǎng)度約為8 700 nt，定位于人類(lèi)染色體11q13.1的 lncRNA。MALAT-1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，如乳腺癌細(xì)胞，其高表達(dá)與細(xì)胞高增殖擴(kuò)散能力相關(guān)[12－15]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達(dá)水平明顯高于乳腺良性疾病者[16]。但是，外周血中過(guò)表達(dá)的MALAT-1與乳腺癌基因分型的關(guān)系及其較傳統(tǒng)標(biāo)志物CA153、CA125對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）方法檢測(cè)MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達(dá)，分析血漿MALAT-1與各臨床病理特征的相關(guān)性以及對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2016年1月至2017年8月在鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院及鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌切除術(shù)患者60例；年齡為41～82歲，中位年齡50歲。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)手術(shù)、放療及化療。共收集到60例配對(duì)的乳腺癌組織及癌旁組織（距腫瘤＞5 cm，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常乳腺組織且不伴雜質(zhì)），離體30 min內(nèi)保存于液氮罐中。選取同期在鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院行乳腺腫塊切除術(shù)，術(shù)后病檢確診為乳腺纖維瘤的女性患者60例，年齡29～67歲，中位年齡49歲?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，所有試驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 組織 RNA提取試劑 RNAiso Plus及血漿 RNA提取試劑 RNAiso Blood，Prime-ScriptTMRTⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR?Premix ExTaqⅡ擴(kuò)增試劑盒（大連寶生物TaKaRa公司）；lncRNA MALAT-1引物由廣州銳博生物科技公司合成；血漿CA153和癌胚抗原檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司）。

1.2.2 主要儀器 C1000TM熒光定量PCR儀器、凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc TMXRS＋凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；微量分光光度儀（北京美林恒通儀器有限公司）；Cobas e601化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士Roche公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血樣采集及處理 所有患者于術(shù)前1 d采集空腹全血5 mL，于EDTA-K2抗凝管，2 000 r/min離心20 min，取血漿，于－80℃保存。

1.3.2 組織和血漿 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNAiso試劑提取組織與血漿中的RNA。行純度和完整性檢測(cè)，剔除不合格標(biāo)本。采用試劑盒（Prime-ScriptTMRTⅡ）行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以提取的總RNA為模板，反應(yīng)總體積為20μL。加入相應(yīng)試劑后于PCR儀內(nèi)進(jìn)行cDNA合成。產(chǎn)物于－80℃保存。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè) MALAT-1的表達(dá) MALAT-1引物序列及退火溫度見(jiàn)表1，GAPDH作為內(nèi)參[11－13]。應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后SYBR?GreenⅠ熒光信號(hào)水平。20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用熔解曲線(xiàn)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物純度。采用相對(duì)定量2－ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

表1 引物序列和退火溫度

1.3.4 血漿CA125和CA153含量檢測(cè) 采用Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血漿中CA125及CA153含量。CA125參考范圍為0～35 U/mL，CA153參考范圍為0～30 U/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 MedCalc 11.4.2.0繪制ROC曲線(xiàn)。非正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)±四分位數(shù)間距（M±QR）表示；兩組獨(dú)立樣本間比較采用Mann-WhineyU檢驗(yàn)，兩組配對(duì)樣本間采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)兩個(gè)隨機(jī)變量之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達(dá)

由圖1可見(jiàn)，乳腺癌組織MALAT-1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－6.737，P＜0.01）。乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達(dá)水平明顯高于纖維瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－9.449，P＜0.01）。

2.2 血漿與乳腺癌組織中MALAT-1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析顯示，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達(dá)水平與癌組織的表達(dá)水平呈一定的正相關(guān)（rs＝0.501，P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)組織和血漿中MALAT-1的表達(dá)

圖2 乳腺癌組織和血漿中MALAT-1表達(dá)的相關(guān)性

2.3 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

對(duì)乳腺癌患者的病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示患者血漿MALAT-1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及基因分型相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；與患者年齡、TNM分期、病理類(lèi)型、雌激素受體、孕激素受體、cerbB-2、p53及 Ki67無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表 2、圖3。

表2 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 M±QR

續(xù)表2

圖3 MALAT-1在不同乳腺癌患者血漿中的表達(dá)

圖4 血漿中MALAT-1、CA125和CA153診斷乳腺癌的ROC曲線(xiàn)

2.4 血漿中MALAT-1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值

由圖4可見(jiàn)，乳腺癌患者血漿中MALAT-1過(guò)表達(dá)曲線(xiàn)下面積（AUC＝0.961）明顯大于 CA125（AUC＝0.618，P＝0.022）和 CA153（AUC＝0.623，P＝0.016）。MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153；聯(lián)合應(yīng)用3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的診斷敏感度高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。見(jiàn)表3。

表3 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的敏感度和特異性

3 討論

MALAT-1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，可通過(guò)提高B-Myb的表達(dá)使細(xì)胞從G1期向S期、G2期向M期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[12，17]。研究證明[18－19]，可根據(jù)外周血細(xì)胞中 MALAT-1表達(dá)的差異區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者和健康者，表明其可作為非小細(xì)胞肺癌的診斷和預(yù)后指標(biāo)。MALAT-1與乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)高濃度 17β-雌二醇（E2）可使下游靶點(diǎn)MALAT-1表達(dá)水平下降，從而減弱MALAT-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血漿MALAT-1水平較良性結(jié)節(jié)者明顯升高，其高表達(dá)可作為乳腺癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)乳腺癌患者癌組織中MALAT-1表達(dá)較癌旁組織明顯增高，其血漿中MALAT-1水平較乳腺纖維瘤患者明顯增高。為更加明確血漿MALAT-1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值，對(duì)乳腺癌患者血漿中高表達(dá)的MALAT-1及乳腺癌傳統(tǒng)標(biāo)志物CA125和CA153繪制ROC曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153，聯(lián)合3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的診斷敏感度高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。此外，乳腺癌患者血漿MALAT-1水平與組織MALAT-1水平具有一定相關(guān)性，這些均表明血漿MALAT-1可能為乳腺癌診斷的潛在標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，血漿MALAT-1表達(dá)水平與基底樣型乳腺癌以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。近幾年采用基因表達(dá)和免疫組化的方法將乳腺癌分為L(zhǎng)uminalA、LuminalB、cerbB-2過(guò)表達(dá)型和基底樣型四大類(lèi)。其中，基底樣型乳腺癌又稱(chēng)三陰性乳腺癌，指雌激素受體、孕激素受體和cerbB-2表達(dá)均為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌患者15%，其生物學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為侵襲性強(qiáng)，易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因缺乏內(nèi)分泌及抗cerbB-2治療的靶點(diǎn)，此類(lèi)乳腺癌患者預(yù)后較差[21－23]。后續(xù)我們將進(jìn)一步研究MALAT-1對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上所述，血漿MALAT-1有望成為乳腺癌診斷的潛在分子標(biāo)志物。后續(xù)將隨訪(fǎng)60例乳腺癌患者的預(yù)后來(lái)探索MALAT-1在乳腺癌中的臨床實(shí)用價(jià)值。

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