人源多能干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞

杜盼，余江南，徐希明

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

原位肝移植是目前唯一能有效治療肝臟嚴(yán)重疾病的方法[1－2]。然而，由于器官短缺，近年來因為肝臟疾病而死亡的人數(shù)不斷增加[3]；此外，世界范圍內(nèi)的肝臟疾病發(fā)病率也在不斷上升。肝細(xì)胞移植的臨床試驗已取得了極大進(jìn)展[4]，但作為替代肝臟移植的肝細(xì)胞移植仍然需要解決肝細(xì)胞來源問題[5]。目前，很多研究都致力于尋找一種能夠穩(wěn)定產(chǎn)生功能性肝細(xì)胞的可行方法[6－9]，其中，可能會成為肝細(xì)胞不竭來源的細(xì)胞就是人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。hiPSCs具有自我更新和多向分化能力[10－13]，與人源胚胎干細(xì)胞（hESCs）相比，hiPSCs涉及的倫理問題較少，且完全不受來源限制。因此，hiPSCs來源的肝細(xì)胞（hiPSC-HEPs）在藥物篩選、細(xì)胞治療以及體外疾病模型等方面的研究中具有重要意義[14]。本實驗以hiPSCs為源細(xì)胞，對其進(jìn)行肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并篩選優(yōu)化出最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，采用最佳誘導(dǎo)方案對其進(jìn)行培養(yǎng)，使其分化為肝細(xì)胞，有望為肝細(xì)胞移植提供一種可行的細(xì)胞來源，從而更好地解決肝細(xì)胞短缺的問題。

1 材料與方法

1.1 主要材料

hiPSCs（本課題組構(gòu)建，來源于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞）[15]；β-ME（美國 Amresco公司）；hESCs-HEPs（由本實驗室以hESCs誘導(dǎo)后形成的肝細(xì)胞，hESCs細(xì)胞購自上海干細(xì)胞庫）；肝細(xì)胞培養(yǎng)基HBM、HCM（美國 Lonza公司）；曲古柳菌素 A（trichostatin A，TSA）購自百靈威科技有限公司；人源甲胎蛋白、白蛋白ELISA試劑盒（美國Abcam公司）；KnockoutTMDMEM培養(yǎng)基、FBS、KnockOutTM血清替代物（Knock-OutTMserum replacement，KSR）、非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA）、谷氨酰胺替代物（glutamax，GM，美國 Gibco公司）；牛血清白蛋白（BSA）、重組抑瘤素 M（oncostatin-M，OSM）、DMSO、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；b-成纖維細(xì)胞生長因子 （b-FGF）、a-FGF、FGF-4、人 表 皮 生 長 因 子（hEGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）均為美國PeproTech公司產(chǎn)品；性別決定Y框轉(zhuǎn)錄因子17（sex determining region Y—box 17，SOX17）的抗體（美國Abcam公司）；蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物（美國Invitrogen公司）；PVDF膜（瑞士 Roche公司）；Immobilon ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）；人源丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及乳酸脫氫酶（LDH）酶聯(lián)免疫試劑盒購自山東煙臺生物科技研究所；抗體 GAPDH、細(xì)胞色素 P450（CYP450）、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 干細(xì)胞培養(yǎng)及最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 先以 KnockoutTMDMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入 24%KSR，1×GM，1×NEAA，0.1 mmol/Lβ-ME，100 U/mL青霉素/鏈霉素（P/S）和4.8 ng/mL bFGF，配制成 hESCs培養(yǎng)基。然后將hiPSCs置于hESCs培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Ⅳ型膠原酶消化傳代。

1.2.2 篩選最佳誘導(dǎo)方案 按照表1中的培養(yǎng)步驟和誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成，分別考察4種肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號和Ⅳ號）誘導(dǎo)細(xì)胞分化的能力，篩選出hiPSCs的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成。具體操作：將“1.3.1”中培養(yǎng)的克隆球接種到24孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁后棄掉原有培養(yǎng)基，分別換成上述4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。分別收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第0，3，7，11，15，19，23，27，32天的細(xì)胞上清液，利用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測不同時間點上清液中甲胎蛋白、白蛋白含量，從而篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基（樣本量＝3，重復(fù)3次）。最優(yōu)誘導(dǎo)方案為Ⅱ號方案，其誘導(dǎo)流程見圖1。

1.3 二維條件下肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

1.3.1 形態(tài)觀察 采用最佳誘導(dǎo)方案對hiPSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分別在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)第3天、第7天、第11天、第15天、第19天、第21天以及第23天，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

表1 4種不同肝細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成

圖1 最優(yōu)誘導(dǎo)方案的誘導(dǎo)流程

1.3.2 免疫熒光法檢測肝臟特征蛋白的表達(dá) 取24孔板中體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d左右類肝臟細(xì)胞，吸棄上清液，用PBS緩沖液洗1遍后，每孔加入1 mL 4%低聚甲醛，4℃固定過夜。PBS洗3遍，5 min/次；加入含 0.3%Triton X-100和 5%BSA的溶液，于37℃封閉30 min；PBS洗3次，5 min/次；加入一抗（均為1∶250）：鼠抗白蛋白抗體，兔抗甲胎蛋白抗體，兔抗CK8抗體，兔抗CK18抗體，鼠抗SOX17抗體，500μL/孔，4℃過夜；PBS洗3次，5 min/次；加入對應(yīng)的熒光二抗，室溫避光反應(yīng)2 h；PBS洗 3次，5 min/次；加入 0.2μmol/L Hoechst33258，染細(xì)胞核，37℃15 min；PBS洗3次，5 min/次；加入甘油，并在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞肝臟特征蛋白的表達(dá) 用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，于樣品中加入適量上樣緩沖液，100℃煮沸10 min；將凝膠放于垂直電泳槽中，加入適量1×SDS-PAGE工作液；在不同的孔道中對蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照和樣品進(jìn)行上樣；80 V恒壓，電泳20 min后調(diào)電壓至 110 V，1～1.5 h；將電泳完成的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃，350mA恒流，2 h；將轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的PVDF膜放入3%BSA中，室溫封閉1 h；一抗（均為1∶250）：兔抗GAPDH抗體，兔抗SOX17抗體，兔抗CK18抗體，兔抗白蛋白抗體，兔抗甲胎蛋白抗體，4℃過夜或室溫2 h；回收一抗后，用1×TBS/T清洗PVDF膜，15min/次，洗3次；加入HRP標(biāo)記的二抗鼠抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫靜置2 h；用1×TBS/T清洗 PVDF膜，15 min/次，洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光儀檢測蛋白條帶。以hiPSCs作為空白對照，hESCs-HEPs作為陽性對照。

1.3.4 二維條件下肝細(xì)胞藥物代謝酶的表達(dá) 誘導(dǎo)結(jié)束后，提取細(xì)胞蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測Ⅰ相代謝酶CYP450、Ⅱ相代謝酶UGT與GST的表達(dá)，同時比較誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后及與hESCs-HEPs的表達(dá)差異，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.5 酶聯(lián)免疫法檢測肝細(xì)胞功能 在誘導(dǎo)分化前、誘導(dǎo)后第3、7、11、15、19、23、27和第 32天，收集上清液，1 500 r/min，離心 5 min，采用 AST、ALT與LDH試劑盒測定上清液中相應(yīng)酶的質(zhì)量濃度，并以hESCs-HEPs作為對照進(jìn)行比較。n＝3，重復(fù)3次。

1.4 三維條件下肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化

1.4.1 形態(tài)觀察 在三維條件下，采用Ⅱ號誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo) hiPSCs分化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

三維條件誘導(dǎo)細(xì)胞21 d，采用4%多聚甲醛將三維支架固定，進(jìn)行石蠟包埋切片，標(biāo)本脫蠟，二甲苯透明，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征。

1.4.2 三維條件下肝細(xì)胞功能檢測 在三維條件下誘導(dǎo)的第 3、7、11、15、19、23、27和 32天，收集上清液，用試劑盒測定上清液中ALT、AST與LDH的質(zhì)量濃度，并與二維條件下的濃度比較。n＝3，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 最優(yōu)誘導(dǎo)方案選擇

酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示，在4種培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，甲胎蛋白分泌量在第11天均達(dá)到最高，隨時間延長，甲胎蛋白含量逐漸降低，直至第32天時分泌量基本“消失”（圖2）。白蛋白在誘導(dǎo)分化1周后含量沒有明顯變化，直至誘導(dǎo)分化2周后才顯著增多（P＜0.05），隨時間延長，白蛋白表達(dá)量也逐漸增加。誘導(dǎo)分化3周后，白蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)培養(yǎng)，含量呈現(xiàn)下降趨勢（圖3）。

圖2 4種培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞后的各時點上清液甲胎蛋白含量（n＝3）

圖3 4種培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞后的各時點上清液白蛋白含量

在4種培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，白蛋白和甲胎蛋白的表達(dá)趨勢基本一致，但同一時刻，兩類蛋白的含量仍然存在差異。Ⅰ號培養(yǎng)基中細(xì)胞產(chǎn)生的甲胎蛋白和白蛋白濃度明顯低于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ號。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ號都是采用多因子、多階段誘導(dǎo)分化模式。Ⅲ號和Ⅳ號誘導(dǎo)分化效果沒有明顯區(qū)別，而Ⅱ號誘導(dǎo)分化效果明顯優(yōu)于Ⅲ和Ⅳ號。Ⅲ號方案誘導(dǎo)分化過程中所使用的因子較多，成本較高，而Ⅳ號方案步驟煩瑣。考慮成本、操作簡便性以及誘導(dǎo)效果，后續(xù)誘導(dǎo)分化均使用Ⅱ號培養(yǎng)基。

2.2 二維條件下肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化

2.2.1 形態(tài)觀察 誘導(dǎo)前培養(yǎng)液中的hiPSCs呈克隆團；誘導(dǎo)分化第3天，克隆團周圍誘導(dǎo)分化出少許細(xì)胞；隨著時間延長，克隆團周圍細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，且形態(tài)逐漸發(fā)生變化；誘導(dǎo)分化至10 d左右，逐漸形成肝前體細(xì)胞。細(xì)胞進(jìn)一步分化為多邊形或者橢圓形。誘導(dǎo)分化第23天，細(xì)胞形態(tài)基本一致，為多邊形或者類圓形，且細(xì)胞核較明顯，部分細(xì)胞呈典型的雙核甚至多核的肝臟細(xì)胞形態(tài)。上述結(jié)果說明在Ⅱ號培養(yǎng)基中，hiPSCs被成功誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。見圖4。

2.2.2 肝臟特征蛋白的表達(dá) 免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化成的細(xì)胞能夠高表達(dá)SOX17，早期肝臟標(biāo)志蛋白甲胎蛋白和白蛋白以及成熟肝細(xì)胞標(biāo)志蛋白CK8與CK18均表達(dá)陽性。上述結(jié)果表明hiPSCs被成功誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞。見圖5。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也顯示，hiPSCs很少表達(dá)甚至不表達(dá)肝臟特征蛋白，而hiPSCs-HEPs中的肝臟特征蛋白（甲胎蛋白、白蛋白、CK8、CK18、SOX17）表達(dá)量均明顯增加，與hESCs-HEPs中的肝臟特征蛋白表達(dá)水平相似。見圖6。

2.2.3 肝細(xì)胞藥物代謝酶的表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前的hiPSCs很少表達(dá)甚至不表達(dá)CYP450、UGT和 GST，而 hiPSCs-HEPs與 hESCs-HEPs中CYP450、UGT與GST的表達(dá)均較明顯。見圖7。

2.2.4 肝細(xì)胞功能 hiPSCs誘導(dǎo)分化過程中AST、ALT與LDH含量的變化趨勢與hESCs基本一致，間接反映了hiPSCs-HEPs具有正常肝細(xì)胞功能。見圖8、圖9、圖10。

2.3 三維條件下肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化

2.3.1 形態(tài)觀察 誘導(dǎo)分化第3天，克隆團周圍出現(xiàn)少量單個細(xì)胞，克隆團慢慢松散；第7天時，克隆團周圍單個細(xì)胞慢慢增多；第11天時，克隆團已經(jīng)松散成一片，單個細(xì)胞越來越多，且呈明顯的肝細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)；隨后，克隆團慢慢分化為單個肝細(xì)胞樣 細(xì)胞，不再呈現(xiàn)克隆團形態(tài)。見圖11。

圖4 hiPSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)過程各時段細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡×100）

圖5 人源多能干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞中肝臟特征蛋白的表達(dá)（免疫熒光染色×100）

HE染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)結(jié)束后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的雙核甚至多核現(xiàn)象，這是肝細(xì)胞最典型的特征，說明在三維培養(yǎng)體系下，hiPSCs被成功誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。見圖12。

圖6 人源多能干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞中特征蛋白的表達(dá)

圖7 二維條件下誘導(dǎo)形成的肝細(xì)胞藥物代謝酶CYP450、UGT、GST的表達(dá)

圖8 二維條件下兩類肝細(xì)胞上清液中AST含量（n＝3）

圖9 二維條件下兩類肝細(xì)胞上清液中ALT含量（n＝3）

圖10 二維條件下兩類肝細(xì)胞上清液中LDH含量（n＝3）

2.3.2 肝細(xì)胞功能檢測 酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示，hiPSCs-HEPs在三維培養(yǎng)條件下的 ALT、AST、LDH變化趨勢與二維條件下基本一致，說明在三維培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)形成的肝細(xì)胞具有正常的肝細(xì)胞功能。見圖13、圖14、圖15。

3 討論

目前，針對肝癌等終末期肝病最有效的治療手段仍然為肝移植。然而，由于供體的嚴(yán)重短缺，該治療手段無法普及；因此，可以用人工肝支持系統(tǒng)暫時替代肝臟相關(guān)功能，從而幫助患者度過危險期以待肝細(xì)胞再生。理論上，由于安全性好、功能相同、同源等特點，成人肝臟細(xì)胞被認(rèn)為是生物人工肝理想的細(xì)胞來源[4]。然而，由于受到來源及倫理學(xué)影響，建立肝細(xì)胞庫十分困難。迄今為止，應(yīng)用最多的細(xì)胞為豬肝細(xì)胞，然而，排斥反應(yīng)與免疫原問題，使其推廣與應(yīng)用受到限制。

由于具有轉(zhuǎn)化為不同細(xì)胞的能力，近年來干細(xì)胞始終是細(xì)胞替代療法的研究熱點，生物人工肝的肝細(xì)胞來源也有望從干細(xì)胞獲得，包括hESCs、iPSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞。ESCs的應(yīng)用受到倫理學(xué)問題困擾。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取有限，且不易建立細(xì)胞系，無法滿足生物人工肝所需要的細(xì)胞數(shù)量要求。與ESCs類似，iPSCs能夠自我更新、增殖與分化，與此同時，還能規(guī)避ESCs面臨的倫理及法律問題，且不存在目前常用的細(xì)胞異種問題，有望成為治療肝癌終末期肝病新的細(xì)胞來源，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[16－17]。

本實驗通過聯(lián)合使用激活素A、HGF、Wnt3a和OSM等細(xì)胞因子對重編程生成的hiPSCs進(jìn)行多階段誘導(dǎo)分化，明顯提高了hiPSCs的肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化效率。在二維條件下，對誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和優(yōu)化，經(jīng)酶聯(lián)免疫實驗發(fā)現(xiàn)Ⅱ號培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果較好，能將hiPSCs誘導(dǎo)為具有肝細(xì)胞形態(tài)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的肝細(xì)胞樣細(xì)胞能夠陽性表達(dá)肝細(xì)胞特征蛋白，且表達(dá)水平與hESCs-HEPs類似，而誘導(dǎo)前的hiPSCs很少表達(dá)甚至不表達(dá)肝細(xì)胞特征蛋白；酶聯(lián)免疫實驗結(jié)果顯示，二維條件下誘導(dǎo)形成的細(xì)胞具有正常肝功能。

圖11 三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡×100）

圖12 三維培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)形成的肝細(xì)胞（HE染色×200）

圖13 二維與三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞上清液中AST含量比較（n＝3）

圖14 二維與三維培養(yǎng)條件下上清液中ALT含量比較（n＝3）

圖15 二維與三維培養(yǎng)條件下LDH含量比較（n＝3）

與二維培養(yǎng)相比，三維體系能更好地模擬體內(nèi)組織器官天然的微環(huán)境。在體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中，不僅存在細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，還存在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用。這些細(xì)胞外基質(zhì)對細(xì)胞生長、分化以及組織形態(tài)的保持具有多重功能。本研究在三維條件下對hiPSCs進(jìn)行肝細(xì)胞誘導(dǎo)，HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈現(xiàn)典型的肝細(xì)胞雙核現(xiàn)象，初步判斷肝細(xì)胞形成。對二維及三維培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)形成的肝細(xì)胞功能進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在三維培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)形成的細(xì)胞具有肝細(xì)胞典型的雙核或多核特征，且具有正常肝細(xì)胞功能。三維條件下AST、ALT以及LDH含量高于二維條件下，其原因可能是三維體系中細(xì)胞密度較大，但濃度均在正常范圍內(nèi)，表明三維培養(yǎng)條件下形成的肝細(xì)胞功能并未受到損傷。

上述結(jié)果表明，本實驗中的肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)方案能夠提供數(shù)量充足的人源肝細(xì)胞，從而為肝細(xì)胞移植提供了實驗基礎(chǔ)。但是，各細(xì)胞因子在肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的分子機制以及如何解決細(xì)胞分選等問題，仍亟待進(jìn)一步研究。

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