miR-3691-3p靶向調(diào)控E2F3/PRDM1對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

孫莉，牛涵波，徐義英，孫茂民

（蘇州大學實驗動物中心，江蘇蘇州215123）

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)中最為多見的惡性腫瘤，從全球來看，前列腺癌的發(fā)生率居男性惡性腫瘤第二位，在歐美國家前列腺癌的死亡率僅僅低于支氣管肺癌[1]。近年來，前列腺癌的死亡率逐漸增加，在美國，患者由2014年29 480例增加到2015年220 800例[2－3]。對于前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制已有一定了解，例如分子遺傳機制擾亂了細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、自噬和衰老的平衡[4]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類高度穩(wěn)定的非編碼小分子RNA，其分子大小約為21～23個核苷酸序列[5－6]。其通過與同源 mRNA的 3′非編碼區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）特異性序列的結(jié)合抑制多種蛋白的翻譯[7]。miRNA靶基因蛋白的預測及驗證是探討其分子機制及其生物學特性的必要步驟。根據(jù)miRNA序列5′端的2－8位核苷酸基本上都能與靶基因mRNA序列3′-UTR完全互補這一原理[8]，我們借助 Targetscan[9]、miRanda[10]、PicTar[11]和 DIANA-microT[12]等 miRNA靶基因預測軟件，分別預測了miR-3691-3p前200個靶基因，求交集后僅剩下9個靶基因；進一步運用miR-Ontology Database數(shù)據(jù)庫篩選出與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的靶基因，分別為PR結(jié)構(gòu)域蛋白1（PR domain containing 1，PRDM1）和 E2F3（E2F transcription factor 3）。

鋅指轉(zhuǎn)錄阻遏因子PRDM1也被稱為Blimp-1，是PRDM家族中具有代表性的成員[13]。PRDM1在造血性腫瘤中具有重要作用[14]。E2F3屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠參與調(diào)控細胞增殖，是一種與增殖強相關(guān)的癌基因[15]。但是有關(guān)E2F3和PRDM1作為靶基因在前列腺癌中作用的研究鮮有報道。DU145細胞株是從前列腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的，分化程度低，為雄激素非依賴的前列腺癌細胞，具有強大的轉(zhuǎn)移潛能，缺乏內(nèi)源性的雄激素受體的表達，主要用于研究晚期激素非依賴性前列腺癌的進展。本實驗首先驗證E2F3和PRDM1是否為miR-3691-3p的靶基因，再應(yīng)用RNA干擾技術(shù)探究低水平的E2F3和PRDM1對DU145細胞株的增殖、遷移和侵襲能力的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

DU145細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；胰蛋白酶（Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；LipofectamineTM2000、DEPC水（Invitrogen公司）；Trizol試劑、雙染蛋白質(zhì)標準品（天根生化科技有限公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白標準品（Thermo公司）；PVDF膜（Millipore公司）；兔抗E2F3多克隆抗體、羊抗PRDM1單克隆抗體、鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體（Abcam公司）；胎牛血清、DMEM（高糖）培養(yǎng)基（Gibco公司）。

1.2 細胞株的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將DU145細胞置于10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中以進行后續(xù)實驗。取將要進行傳代的DU145細胞分別接種于96孔板、24孔板和6孔板中，待所鋪細胞生長至50%～70%時，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，每孔100 nmol/L。培養(yǎng)24 h或48 h后，收集細胞進行后續(xù)實驗。E2F3 siRNA，PRDM1 siRNA和陰性對照siRNA及miR-3691-3p成熟體、陰性對照均購于廣州市銳博生物科技有限公司。miR-3691-3p mimic序列：5′-ACCAAGUCUGCGUCAUCCUCUC-3′；陰性對照 mimic序列：5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′；E2F3 siRNA序列：5′-GCACTACGAAGTCCAGATA-3′；PRDM1 siRNA序列：5′-GGACCTCGATGACTTTAGA-3′；陰性對照 siRNA序列：5′-UUUTGATCAUTGATGAAA-3′。

1.3 實時熒光定量PCR檢測E2F3和PRDM1 mRNA的表達

將不同濃度梯度 miR-3691-3p mimic（10、50、100 nmol/L）轉(zhuǎn)染入 DU145細胞內(nèi)；Trizol一步法抽提DU145細胞中總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上所提供的方法，將所獲得的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。并按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)。E2F3引物序列上游：5′-GATGGGGTCAGATGGAGAGA-3′，下 游：5′-GAGACAC-CCTGGCATT-GTTT-3′；PRDM1引物序列上游：5′-AAAAGAAACATGACCGGCT-ACAAG-3′，下游：5′-GGTGGACCTTCAGATTGGAGA-3′；以 GAPDH為對照，引物序列上游：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。反 應(yīng) 條 件：95℃預變性10 min，95℃ 10 s，60℃ 60s，40個循環(huán)。目的基因表達量按照2－ΔΔCt法計算。

將E2F3 siRNA、PRDM1 siRNA、陰性對照 siRNA轉(zhuǎn)染入DU145細胞內(nèi)，RNA的提取及實時熒光定量PCR反應(yīng)同上。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法測定E2F3/PRDM1靶基因的蛋白水平

收集6孔板中已經(jīng)進行轉(zhuǎn)染的DU145細胞，實驗分為 miR-3691-3p mimic 10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和陰性對照組，并重復3次獨立實驗。收集細胞提取總蛋白，利用PMSF和裂解液的混合液裂解蛋白。取相應(yīng)的總蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。在PVDF膜上進行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，奶粉封閉后，于相應(yīng)的一抗中4℃過夜（抗體稀釋比為1∶1 000）。洗滌3次后，二抗在室溫中放置1 h后，進行ECL液顯影，并進行成像反應(yīng)。

1.5 MTT法測定DU145細胞的增殖能力

取處于對數(shù)生長時期的DU145細胞，以1×103/孔的數(shù)量鋪于96孔板，每組有5個復孔，分為陰性對照組、E2F3 siRNA組和PRDM1 siRNA組轉(zhuǎn)染細胞，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于1、2和3 d后，于每孔中加20μL（5 g/L）新配置的 MTT液，放置4 h后去除板中液體，然后將150μL DMSO加入至每孔中，振蕩10 min進行混勻，使藍紫色結(jié)晶物甲臜充分溶解。隨后酶標儀570 nm下測定其光密度（D）值。

1.6 劃痕實驗測定DU145細胞的遷移能力

將DU145細胞懸液（2×105個/mL）每孔2 mL鋪于6孔板中。細胞分為陰性對照組、E2F3 siRNA組和PRDM1 siRNA組進行轉(zhuǎn)染，6 h后換液。換液前用200μL的黃色滅菌槍頭在每孔中央劃一條直線，將板中原先液體吸去，緩沖液洗3次，洗去懸浮的細胞，并在每孔中加入新鮮純DMEM。以設(shè)置劃線為開始時間，在顯微鏡下拍攝0、24、48 h時DU145細胞的遷移情況，并統(tǒng)計劃痕的愈合速率。

1.7 Transwell法測定DU145細胞侵襲能力

準備基質(zhì)膠：將凍存于－20℃中的Matrigel膠放于4℃，使其融化。取300μL的純DMEM，并將60μLMatrigel膠放入其中，混勻后各50μL放于上室；在37℃培養(yǎng)箱中放6 h，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)。將制備的細胞懸液（1×105個/mL）500μL/孔接種于 24孔板中。實驗分為陰性對照組、E2F3 siRNA組和PRDM1 siRNA組進行轉(zhuǎn)染。每次實驗重復3次。轉(zhuǎn)染換液后，培養(yǎng)24 h。消化細胞后，純DMEM洗滌3次，細胞計數(shù)板計數(shù)，并利用DMEM進行重懸。于上室中每孔加上述已配置的100μL細胞懸液（1×105個/mL），下室中加入500μL含10% 血清的DMEM。37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。利用PBS緩沖液將取出的小室輕輕沖洗3遍后，用4%低聚甲醛固定15 min。于0.2%結(jié)晶紫染色液中染色10 min，雙蒸水洗2遍后，用棉簽清除上表面殘留的原有細胞，顯微鏡下觀察。在鏡下隨機選擇5個視野進行拍照，計算穿膜細胞數(shù)并取平均值以檢測細胞的侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3691-3p mimic轉(zhuǎn)染后DU145細胞E2F3、PRDM1 mRNA的表達

隨著miR-3691-3p mimic濃度的升高，在轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L時，DU145細胞株中 E2F3、PRDM1 mRNA的表達量均比陰性對照組明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測DU145細胞E2F3、PRDM 1 mRNA的表達

2.2 miR-3691-3p mimic轉(zhuǎn)染后DU145細胞E2F3、PRDM1蛋白的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在DU145細胞中靶基因蛋白表達量均隨著轉(zhuǎn)染濃度的增大而降低，在轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L時，E2F3和PRDM1的蛋白表達量均最低（P＜0.01），見圖2。初步確認 E2F3和PRDM1為miR-3691-3p的靶基因。

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測DU145細胞E3F3、PRDM 1蛋白表達

2.3 實時熒光定量PCR驗證E2F3 siRNA、PRDM1 siRNA轉(zhuǎn)染效率

與陰性對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染E2F3 siRNA和PRDM1 siRNA后，DU145細胞中E2F3、PRDM1 mRNA表達水平顯著降低（t＝31，P＜0.01；t＝10.44，P＜0.01），見圖3。表明 E2F3和 PRDM1 siRNA能夠敲低兩個候選靶基因在DU145細胞株中的水平。

圖3 實時定量PCR驗證siRNA在細胞中的轉(zhuǎn)染效率

2.4 低表達的E2F3和PRDM1對DU145細胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，相比于陰性對照組，轉(zhuǎn)染E2F3 siRNA和PRDM1 siRNA后，DU145細胞的增殖能力明顯被抑制（P＜0.01，圖4）。

圖4 M TT實驗測定siRNA對DU145細胞增殖的影響

2.5 低表達的E2F3和PRDM1對DU145細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，相比于陰性對照組，轉(zhuǎn)染E2F3 siRNA的DU145細胞遷移被顯著抑制（P＜0.01），而PRDM1 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力沒有明顯變化（P＞0.05）。見圖5、圖6。

2.6 低表達的E2F3和PRDM1對DU145細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，相比于陰性對照組，轉(zhuǎn)染siRNA后DU145細胞的侵襲能力被明顯抑制（E2F3：t＝6.895，P＜0.01；PRDM1：t＝9.286，P＜0.01）。見圖7。

3 討論

大量的體內(nèi)、體外實驗研究表明，miRNAs在多種癌癥的發(fā)展進程中具有不可替代的作用[16－18]。在腫瘤中，miRNA主要通過其下游的靶蛋白來發(fā)揮自身的調(diào)節(jié)能力。miRNA能有效地與靶蛋白的3′-UTR區(qū)結(jié)合來抑制翻譯作用或者降解mRNA，從而起到對靶蛋白表達的干擾作用[19]。為了探究miR-3691-3p在前列腺癌中的作用機制，我們利用三大生物信息學網(wǎng)站預測了miR-3691-3p的候選靶蛋白，最后篩選出E2F3和PRDM1。

E2F3屬于E2F家族，能夠調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡從而促進腫瘤的生長。E2F轉(zhuǎn)錄因子在癌癥中占有重要地位，在視網(wǎng)膜母細胞瘤中可調(diào)控其下游靶基因來抑制腫瘤的增殖。不同的E2F在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有不同程度的促進或抑制功能[20－21]。已有報道顯示E2F3受多種miRNAs的調(diào)控。例如，miR-125b通過靶向調(diào)節(jié)E2F3來阻礙膀胱癌細胞的集落形成和裸鼠腫瘤發(fā)展。E2F3可作為miR-195的靶蛋白阻礙人膠質(zhì)細胞瘤的增殖和侵襲。已有研究表明，PRDM1作為RAS/RAF/AP-1信號通路的調(diào)節(jié)因子，具有促進肺癌細胞遷移的作用；作為NF-κB下游效應(yīng)因子，可激活RelB、Bcl-2和RAS通路，促進乳腺癌的遷移[22]。

圖5 劃痕實驗檢測3組DU145細胞的遷移能力（×100）

圖6 siRNA對DU145細胞遷移能力的影響

本實驗結(jié)果顯示，隨著miR-3691-3p mimic轉(zhuǎn)染濃度的提高，DU145細胞E2F3和PRDM1 mRNA和蛋白表達水平逐漸下降。初步得出結(jié)論：在前列腺癌細胞中由于miR-3691-3p的降低，促使E2F3和PRDM1明顯升高；而在miR-3691-3p高表達時，靶基因低表達。于是我們進一步將細胞中靶基因的表達量降低，觀察細胞的生物學行為的變化。結(jié)果表明，敲低E2F3均抑制了DU145細胞的增殖、遷移和侵襲能力；而PRDM1的低表達只對細胞的增殖和侵襲能力有明顯的抑制作用，對遷移能力的影響較弱，需要進一步的實驗進行驗證。

圖7 Transwell檢測siRNA對DU145細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色×100）

綜上所述，低表達水平的miR-3691-3p促進前列腺癌發(fā)生發(fā)展進程和惡性轉(zhuǎn)化，其機制是通過調(diào)控下游靶基因E2F3和PRDM1表達量升高所致。沉默靶基因在DU145細胞中的表達，其增殖/遷移和侵襲能力被顯著抑制。本研究初步闡明了miR-3691-3p調(diào)控前列腺癌發(fā)展進程的分子機制，為前列腺癌的臨床診斷和靶向治療提供了新思路。

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