外源葡萄糖增強(qiáng)高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型pepc水稻耐旱性的生理機(jī)制

張金飛 李 霞 何亞飛 謝寅峰

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外源葡萄糖增強(qiáng)高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型水稻耐旱性的生理機(jī)制

張金飛1,2李 霞1,*何亞飛1,2謝寅峰2

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 / 江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心 / 國家水稻改良中心南京分中心, 江蘇南京 210014;2南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院, 江蘇南京 210037

為揭示葡萄糖參與植物耐旱性的內(nèi)在機(jī)制, 以高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoe-nolpyruvate carboxylase, PEPC)基因(C4)水稻(PC)和受體“Kitaake”(WT)為材料, 通過盆栽和水培試驗(yàn), 研究外施葡萄糖聯(lián)合干旱處理下, 功能葉片的光合參數(shù)、總可溶性糖及其組分、Ca2+、NO含量、己糖激酶活性、B類鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin B-like, CBL)與蔗糖非發(fā)酵1 (sucrose nonfermenting-1, SNF1)相關(guān)蛋白激酶(SNF1-related protein kinase 3s, SnRK3s)基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明, 在盆栽試驗(yàn)中, 分蘗期外施3%葡萄糖聯(lián)合干旱處理對(duì)水稻的產(chǎn)量及其構(gòu)成因子影響不顯著, 而在孕穗期處理, PC的株高、穗數(shù)、每穗實(shí)粒重和單株產(chǎn)量均顯著高于WT。在水培試驗(yàn)中, 外施1%葡萄糖和12% (m/v)聚乙二醇6000 (polyethylene glycol-6000, PEG-6000)模擬干旱處理, 均顯著提高了PC功能葉片的凈光合速率(n)、氣孔導(dǎo)度(s)和羧化效率(CE), 葉片內(nèi)蔗糖和果糖的含量也均顯著高于WT。值得關(guān)注的是, PC葉片己糖激酶(hexokinase, HXK)活性、/基因的相對(duì)表達(dá)量在外施1%葡萄糖聯(lián)合12% PEG模擬干旱處理下均顯著低于12%PEG處理, 而NO含量則顯著上升。相關(guān)性分析也表明, PC中n、胞間CO2濃度(i)和s分別與葡萄糖含量、HXK活性和基因表達(dá)顯著相關(guān)。外施葡萄糖處理可上調(diào)PC糖水平, 下調(diào)其和基因表達(dá), 誘導(dǎo)NO參與葉片氣孔調(diào)節(jié), 從而增強(qiáng)保水能力, 保持光合能力穩(wěn)定, 最終表現(xiàn)為耐旱。

水稻; 葡萄糖; 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 氣孔導(dǎo)度; 干旱

水稻作為最重要的谷類作物之一, 養(yǎng)活了全世界一半以上的人口[1]。近年來高溫和干旱等極端天氣頻發(fā), 水稻受到不利影響而減產(chǎn)[2]。目前, 采用常規(guī)育種方法改善和提高作物產(chǎn)量的步伐正在減慢或停滯, 主要因?yàn)樽魑飭稳~光合能力幾乎沒有改善。因此, 進(jìn)一步提高作物單葉光合能力, 將成為今后作物增加產(chǎn)量的關(guān)鍵途徑之一[3]。研究表明, 玉米等C4植物, 在干旱條件下可比C3植物具有更高的光合作用和水分利用效率, 且適應(yīng)干旱[4]。已通過基因工程將C4光合基因如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基因() 引入水稻, 獲得了高表達(dá)的轉(zhuǎn)C4型基因水稻, 提高了水稻光合效率和產(chǎn)量[5], 這作為一條重要的作物產(chǎn)量改良技術(shù)途徑已被廣泛重視[6]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC; EC4.1.1.31)不可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)羧化, 產(chǎn)生草酰乙酸(oxaloacetate, OAA)和無機(jī)磷酸(phosphoric acid, Pi), 是重要的多功能酶[7-8]。已有研究表明, 高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型基因水稻在農(nóng)藝性狀上與野生型水稻相比, 具有較高的千粒重、單株有效穗、穗長和單株產(chǎn)量[9-10]。在干旱條件下, 該轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出耐旱、耐強(qiáng)光能力, 能減緩干旱脅迫對(duì)水稻光合的抑制[10-13]。其保衛(wèi)細(xì)胞中PEPC可特異性地調(diào)控, 導(dǎo)致蘋果酸或草酰乙酸積累, 從而促進(jìn)氣孔開放, 增強(qiáng)光合作用[5]。而3,3-二氯-二羥基膦?；?甲基-2-丙烯酸酯(DCDP, 3,3-dichloro-2-dihydroxyphosphinoyl-methyl-2- propenoate)(PEPC的抑制劑)可限制氣孔開放[14]。高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型基因水稻可通過H2O2、NO和鈣離子參與調(diào)節(jié)PEPC酶活性和基因的表達(dá), 從而在氣孔開放調(diào)節(jié)中起作用[8-9,15]。

植物光合作用產(chǎn)生糖是一個(gè)重要的過程, 并能通過糖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo), 調(diào)整生長發(fā)育, 保持能量平衡, 響應(yīng)代謝及環(huán)境波動(dòng), 從而表現(xiàn)脅迫耐受性[16]。不同植物葉片中, 葡萄糖響應(yīng)的差異性很可能是物種的結(jié)構(gòu)、發(fā)育階段以及碳和氮儲(chǔ)存方式或使用效率的不同所引起[17-19]。糖還與其他信號(hào)成分, 包括激素、miRNA、活性氧(reactive oxygen species, ROS)及其他信號(hào)分子發(fā)生相互作用[20-24]。多種糖信號(hào)已經(jīng)成為從植物胚胎發(fā)生到衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 其中葡萄糖是植物生長和發(fā)育中控制基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞周期進(jìn)程、次級(jí)代謝等最古老的保守信號(hào)分子[25]。全基因組轉(zhuǎn)錄分析揭示, 葡萄糖調(diào)控一系列基因的表達(dá), 包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝和與代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因[25]。葡萄糖信號(hào)主要通過2個(gè)機(jī)制被感知和轉(zhuǎn)導(dǎo), 即通過葡萄糖傳感器的直接感測(cè), 或通過各種能量和代謝物傳感器的間接感測(cè)[25]。其中, 己糖激酶1 (hexokinase1, HXK1; EC2.7.1.1)是具有催化和調(diào)節(jié)作用的雙功能酶, 是進(jìn)化上保守的葡萄糖傳感器, 作為糖產(chǎn)生的生理反饋環(huán), 可被葡萄糖促進(jìn)和被氮素抑制[18-19,26]。此外, 蔗糖非發(fā)酵1 (sucrose nonfermenting-1, SNF1)相關(guān)蛋白激酶(sucrose nonfermenting-1-related protein kinase, SnRKs)也是聯(lián)系糖信號(hào)與脅迫信號(hào)的關(guān)鍵蛋白因子[27]。如SnRK1可被調(diào)節(jié)因子葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G-6-P)和海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate, T-6-P)負(fù)調(diào)控, 從而直接與糖信號(hào)之間建立聯(lián)系[28-29]。但是, 目前有關(guān)SnRKs直接參與信號(hào)的相關(guān)證據(jù)并不多。我們的前期研究發(fā)現(xiàn), 高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型基因水稻中存在較多的可溶性糖[30], 大多數(shù)PEPC在接近胞質(zhì)溶膠的最佳生理pH下, 可被變構(gòu)效應(yīng)子G-6-P正調(diào)節(jié)或被蘋果酸和天冬氨酸負(fù)調(diào)節(jié), 從而響應(yīng)于糖信號(hào), 暗示了糖和PEPC均參與植物生理功能[31]。本研究旨在解析糖參與高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型基因水稻耐旱的生理機(jī)制, 并為通過C4光合特性的改良提高水稻耐旱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以第14代穩(wěn)定遺傳的高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型水稻(以下簡稱PC)和未轉(zhuǎn)基因原種“Kitaake”(以下簡稱WT)作試材, 最初使用轉(zhuǎn)基因材料是由Ku教授饋贈(zèng)的T3植株[5]。水稻種子經(jīng)75%酒精消毒5 min, 去離子水充分沖洗后, 用50%的次氯酸鈉消毒10 min, 再用去離子水充分沖洗, 然后挑選大小一致的種子, 在恒溫黑暗培養(yǎng)箱中25℃催芽3 d。待幼苗長到二葉期時(shí), 轉(zhuǎn)移至國際水稻研究所(International Rice Research Institute)標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液中, 置人工氣候箱以30℃/25℃(晝/夜)、14 h/10 h (光/暗)培養(yǎng)[32]。待秧苗長到五至六葉期, 選擇株型、長勢(shì)、葉片均一的植株, 于晴天的傍晚進(jìn)行處理, 并統(tǒng)一測(cè)定生理指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 水培試驗(yàn)處理 將植株分為2組, 在晴天的傍晚用超微噴霧器噴施1%葡萄糖溶液, 以噴清水作為對(duì)照, 處理后轉(zhuǎn)移到30℃/25℃(晝/夜)人工氣候箱中先暗處理10 h, 再用光照處理2 h, 隨后測(cè)定植株倒二葉的光合參數(shù)。之后將植株轉(zhuǎn)移到含有12% (m/v)聚乙二醇6000 (polyethylene glycol-6000, PEG- 6000)的培養(yǎng)液中(以下稱模擬干旱脅迫), 在光照培養(yǎng)箱中光照處理2 h后, 測(cè)定植株光合參數(shù)。之后取下倒二葉, 迅速在-80℃液氮中保存, 用于測(cè)定其他生理指標(biāo)。同時(shí)測(cè)定處理前后相對(duì)含水量(relative water content, RWC), 在苗期并以RWC作為耐旱性指標(biāo)。

1.2.2 盆栽試驗(yàn)處理 于2016年5月4日至8月10日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專用網(wǎng)室中進(jìn)行。盆栽用土為稻田黏壤土, 盆缽隨機(jī)區(qū)組排放, 進(jìn)行常規(guī)水肥和病蟲管理。在分蘗期和孕穗期, 待盆缽?fù)磷匀宦涓珊? 對(duì)水稻葉片噴施3%葡萄糖溶液, 以噴清水為對(duì)照。隨機(jī)分成兩組, 一組正常灌溉(對(duì)照, CK), 一組自然干旱(drought stress, DS)。自然干旱組, 每3 d噴施3%葡萄糖溶液1次, 共處理5次, 每株共噴施50 mL溶液(以下稱聯(lián)合干旱脅迫), 均以噴清水為對(duì)照(以下稱干旱脅迫)。5次處理結(jié)束后, 所有處理均恢復(fù)正常灌溉, 開花后50 d收獲, 考察產(chǎn)量及其構(gòu)成因子, 以單株產(chǎn)量作為耐旱性指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 相對(duì)含水量 按文獻(xiàn)[33]的方法測(cè)定植株RWC。

1.3.2 糖組分含量 參照Ambavaram等的方法[34]測(cè)定蔗糖、葡萄糖和果糖含量。

1.3.3 光合參數(shù) 參照Li等的方法[35], 使用LI-6400 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA) 便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng), 采用紅藍(lán)光源葉室(LI-6400-40), 設(shè)置光量子通量密度(photosynthetic photon quanta flux density, PPFD) 800 μmol m2s–1, 流速500 μmol s–1。室外溫度25~30℃, 相對(duì)濕度67%~79%, PPFD為(1000±0) μmol m–2s–1, CO2濃度為(390.0±10.5) μmol mol–1, 上午9:00至11:00之間, 選取水稻倒二葉測(cè)定凈光合速率(n, net photosynthesis rate)、氣孔導(dǎo)度(s, stomatal conductance)和胞間CO2濃度(i, intercellular CO2concentration)等, 通過CE =n/i,計(jì)算出羧化效率(CE, carboxylation efficiency)。每個(gè)處理測(cè)定4張葉片, 3次重復(fù)。

1.3.4 鈣離子(Ca2+)和一氧化氮(NO)含量 分別參照Yang等[36]和Murphy與Noack[37]的方法。

1.3.5 己糖激酶活性 參照Schaffer和Petreikov[38]的方法。

1.3.6 總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 根據(jù)Jung等[39]報(bào)道的方法制備總RNA。參考Chen等[8]的方法反轉(zhuǎn)錄, 在PCR儀(ETC811, 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)上進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明書使用SYBR Premix ExII試劑盒[TaKaRa Biotechnology(大連)有限公司]進(jìn)行qRT-PCR分析, 用Applied Biosystems Step One實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)分析。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃ 10 min; 94oC 30 s, 58℃ 40 s和68℃各1 min, 共32次循環(huán)。重復(fù)3次。在Primer3上設(shè)計(jì)引物, 以水稻組成性表達(dá)的基因?yàn)閮?nèi)部參照, 引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析方法

使用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析, 采用Microsoft Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述和作圖。使用2–ΔΔCt方法分析qRT-PCR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分蘗期和孕穗期干旱脅迫下噴施葡萄糖對(duì)水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響

如表2所示, 分蘗期干旱脅迫后, PC的結(jié)實(shí)率顯著高于WT, 但在聯(lián)合干旱脅迫下, PC并沒有顯著提高單株產(chǎn)量。孕穗期干旱脅迫后, PC和WT的株高、穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量均顯著降低, 而聯(lián)合干旱脅迫下, PC的株高、最高分蘗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、每株實(shí)粒重和單株產(chǎn)量均顯著高于WT。表明噴施葡萄糖可以顯著緩解孕穗期干旱脅迫對(duì)PC產(chǎn)量造成的損失。

表1 qRT-PCR的基因和引物

Act: 肌動(dòng)蛋白; CBL: B類鈣調(diào)磷酸酶; SnRK: 蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶。

Act: actin; CBL: calcineurin B-like; SnRK: sucrose nonfermenting-1-related protein kinase.

表2 分蘗期外施葡萄糖聯(lián)合干旱處理對(duì)水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響

CK: 正常灌溉和葉面噴施清水; DS: 干旱脅迫+葉面噴施清水; DS+Glc: 干旱脅迫+葉面噴施3%葡萄糖溶液。表中數(shù)字后標(biāo)以不同的字母表示在5%水平上差異顯著。

CK: irrigation and leaf spray application of water; DS: drought stress and leaf spray application of water; DS+Glc: drought stress and leaf spray application of 3% glucose. Values followed by different letters are significantly different at the 5% probability level.

表3 孕穗期外施葡萄糖聯(lián)合干旱處理對(duì)水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響

縮寫同表2。表中數(shù)字后標(biāo)以不同的字母表示在5%水平上差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Table 2. Values followed by different letters are significantly different at the 5% probability level.

2.2 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻葉片光合參數(shù)的影響

如圖1-A~D所示, 相比于正常生長條件, 干旱脅迫下PC和WT的凈光合速率(n)、胞間CO2濃度(s)以及羧化效率(CE)均顯著降低, 但PC的n、胞間CO2濃度(i)和CE均顯著高于WT, 而s則顯著低(<0.05)。聯(lián)合干旱處理則顯著緩解了PC和WTn和s的下降,i和CE均顯著上升, 而且PC的n和CE均顯著高于WT, 說明外施葡萄糖可一定程度緩解干旱脅迫導(dǎo)致的光合能力下降, 尤其有益于PC。從圖1-B還可以看出, 模擬干旱脅迫下, PC的s顯著低于WT (<0.05), 說明PC通過關(guān)閉氣孔減少水分喪失響應(yīng)脅迫。聯(lián)合干旱脅迫下PC和WT的s均提高, 從而增加光合作用的底物(i), 減少光合能力的下降。值得關(guān)注的是, 在聯(lián)合干旱處理下, PC始終維持比WT高的光合能力, 但其氣孔導(dǎo)度卻始終顯著低于WT?？梢? PC通過調(diào)節(jié)氣孔保持一定程度的關(guān)閉而維持光合作用穩(wěn)定, 可能是其耐旱性強(qiáng)更重要的原因之一。

2.3 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻葉片相對(duì)含水量、可溶性糖、糖組分以及PEPC酶活性的影響

由圖2-A可知, 模擬干旱顯著降低了PC和WT葉片的相對(duì)含水量。而與聯(lián)合干旱脅迫相比, 干旱脅迫下PC的相對(duì)含水量顯著高, 并且在干旱脅迫和聯(lián)合干旱脅迫下, PC相對(duì)含水量都顯著高于WT (<0.05), 說明PC因C4-基因的導(dǎo)入使耐旱性更強(qiáng), 另一方面也說明外施葡萄糖能夠增強(qiáng)水稻葉片保水能力。圖2-B所示, 干旱脅迫下PC和WT的可溶性糖含量均顯著高于正常灌溉, 并且PC可溶性糖含量顯著高于WT (<0.05), 但外施葡萄糖并沒有顯著增加水稻植株內(nèi)總可溶性糖含量。有趣的是, 干旱處理下調(diào)了PC的葡萄糖含量(圖3-B), 而對(duì)蔗糖和果糖并沒有顯著影響(圖3-A和圖3-C), WT中蔗糖和葡萄糖含量顯著增加, 對(duì)果糖則沒有顯著影響(<0.05)。此外, 聯(lián)合干旱處理顯著降低了WT的糖組分含量, 其中蔗糖和果糖水平回落到正常灌溉下的; 而與聯(lián)合干旱處理相比, 干旱處理顯著增加了PC糖組分的含量, 其中葡萄糖含量差異不大, 蔗糖和果糖含量顯著高。圖3-D所示, 各處理PC中PEPC活性均顯著高于WT, 干旱處理進(jìn)一步誘導(dǎo)了PC中的PEPC酶, 其活性顯著提高, 但聯(lián)合干旱處理對(duì)PC中PEPC酶活性影響不大。顯然, 外源葡萄糖在早期干旱響應(yīng)中可能涉及更多的信號(hào)或者轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化, 但還未涉及翻譯水平的響應(yīng)。

圖1 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻葉片光合參數(shù)的影響

CK: 正常灌溉和葉面噴施清水; DS : 干旱脅迫+葉面噴施清水; DS +Glc: 干旱脅迫+葉面噴施1%葡萄糖。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

CK: irrigation and leaf spray application of water; DS: drought stress and leaf spray application of water; DS+Glc: drought stress and leaf spray application of 1% glucose. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

2.4 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻葉片HXK的影響

圖4所示, 相比正常條件, 干旱處理下PC和WT的HXK活性均降低, 外施葡萄糖更加劇了酶活性的降低, 其中PC的HXK活性始終顯著低于WT。因此, 外施葡萄糖引起內(nèi)源糖組分的變化可能通過下調(diào)HXK途徑或者不依賴HXK途徑響應(yīng)干旱脅迫。

圖2 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻葉片相對(duì)含水量和可溶性糖含量的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

圖3 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻蔗糖、葡萄糖、果糖和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

圖4 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻己糖激酶的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

2.5 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻葉片Ca2+和NO的影響

從圖5可知, 兩信號(hào)分子的含量在WT和PC間存在差異, 其中WT葉內(nèi)鈣離子水平在不同處理間表現(xiàn)穩(wěn)定。在干旱脅迫下, PC的鈣離子含量顯著高于WT, 干旱處理顯著誘導(dǎo)PC中鈣離子含量增加, 但外施葡萄糖則消除了PC和WT間的差異。有趣的是, 干旱處理顯著下調(diào)了兩材料NO水平, 而外施糖則顯著提升了兩材料的NO水平, 其中對(duì)于PC, NO水平提升到對(duì)照的水平?？梢? 外施葡萄糖調(diào)節(jié)兩材料的信號(hào)分子恢復(fù)到正常水平, 其中PC的提高更為顯著。

2.6 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻葉片CBL1、CBL10和SnRK3s基因表達(dá)的影響

干旱處理后PC中B類鈣調(diào)磷酸酶1 (calcineurin B-like1, CBL1)基因表達(dá)顯著誘導(dǎo)增加, 而WT則沒有顯著變化, 外施葡萄糖則消除了PC與WT間基因表達(dá)的差異, 這個(gè)變化與鈣水平的變化類似(圖6)。干旱處理下, PC中基因表達(dá)量顯著上升, 聯(lián)合干旱處理下, PC中基因相對(duì)表達(dá)量也顯著高于WT (圖6)?？梢? PC中更敏感感知糖信號(hào)。圖7表明正常條件下, PC的3個(gè)基因和均保持較低的表達(dá)量, 干旱處理下調(diào)了PC中、和的基因表達(dá), 聯(lián)合干旱處理進(jìn)一步加劇了PC中、和基因表達(dá)量的下調(diào), 但顯著上調(diào)了WT的響應(yīng)基因表達(dá), 其基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于PC?？梢? 單獨(dú)干旱處理顯著下調(diào)了PC中、和的基因表達(dá)水平, 而聯(lián)合干旱處理顯著提高了PC中的糖含量(蔗糖和果糖), 高的糖組分作為糖信號(hào)與鈣信號(hào)互作, 可能在一定程度上反饋抑制、和的相對(duì)表達(dá)量, 維持氣孔一定程度的開放, 增加光合作用底物CO2的濃度(i), 從而維持光合作用, 表現(xiàn)為PC耐旱性增強(qiáng), 產(chǎn)量穩(wěn)定。

2.7 噴施葡萄糖聯(lián)合干旱脅迫下PC和WT的單株產(chǎn)量與各個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性

如表4和表5所示, 孕穗期聯(lián)合干旱脅迫下PC單株產(chǎn)量與各參數(shù)間存在顯著的相關(guān)。對(duì)于WT,n與i、n與HXK、HXK與i均存在極顯著相關(guān)性(< 0.01),n與蔗糖、n與、NO與s、HXK與i、與i、與蔗糖、葡萄糖與Ca2+、葡萄糖與、Ca2+與、HXK與均存在顯著相關(guān)性(< 0.05)(表4), 這意味著光合作用的變化與葡萄糖、蔗糖、己糖激酶、NO、Ca2+、和都密切相關(guān)。對(duì)于PC,n與s極顯著相關(guān)(< 0.01), 葡萄糖含量分別與n、s和i顯著相關(guān); HXK活性分別與n、s、i、葡萄糖含量及基因的表達(dá)量顯著相關(guān);分別與n、s顯著相關(guān)(表5)。值得關(guān)注的是, PC的單株產(chǎn)量與顯著相關(guān), PEPC酶活性與果糖含量顯著相關(guān), 說明聯(lián)合干旱處理后, PC中葡萄糖含量顯著影響光合作用。同時(shí), 己糖激酶途徑可能是聯(lián)系光合作用與糖和的中心樞紐, PEPC通過參與調(diào)節(jié)糖含量的變化, 間接介導(dǎo)己糖激酶途徑, 調(diào)控的基因表達(dá), 最終影響產(chǎn)量。

圖5 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻Ca2+和NO的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

圖6 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱處理對(duì)水稻CBL1和CBL10基因表達(dá)量的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(< 0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at< 0.05.

圖7 噴施葡萄糖聯(lián)合12% PEG-6000模擬干旱對(duì)水稻SnRK3.1/ SnRK3.4/SnRK3.21/SnRK3.16基因表達(dá)量的影響

縮寫同圖1。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值表示差異顯著(<0.05)。

Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Bars labeled with different letters are significantly different at<0.05.

3 討論

植物PEPC是催化PEP生物合成OAA的必需酶, 對(duì)于所有C4植物初級(jí)代謝都是關(guān)鍵酶[40]。因此, 將C4-PEPC引入C3植物被認(rèn)為是增強(qiáng)C4光合作用所必需的酶[41-42]。本研究表明, 外施糖改變了內(nèi)源糖如蔗糖和果糖的含量, 并通過下調(diào)糖感受器HXK和與鈣離子相關(guān)的基因的表達(dá)量, 參與調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng), 維持氣孔一定程度的開放, 從而增加了光合作用底物CO2的濃度(i), 維持光合作用, 表現(xiàn)為PC耐旱性增強(qiáng), 產(chǎn)量穩(wěn)定。

在擬南芥和水稻中, 光合能力的增強(qiáng)和可溶性糖含量的增加, 最終表現(xiàn)為生物量和產(chǎn)量的增加[43-44]。有研究報(bào)道, 在干旱脅迫下, 植物中的碳分配從不可溶性碳水化合物(淀粉)向可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)移, 從而積累更多的可溶性碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露糖醇等), 有助于脅迫保護(hù)[45]。本研究中, PC產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的變化也得到相似的結(jié)論。通常認(rèn)為, 糖過度累積會(huì)對(duì)光合作用產(chǎn)生反饋抑制, 從本試驗(yàn)來看, 外施葡萄糖對(duì)水稻植株總可溶性糖含量影響并不大, 而對(duì)內(nèi)糖組分(單糖和二糖)有顯著影響。對(duì)WT而言, 外施葡萄糖增加糖的分解, 糖各組分水平均降低, 而對(duì)于PC, 糖組分則較穩(wěn)定。外施葡萄糖誘導(dǎo)PC中蔗糖和果糖水平顯著增加, 這種表現(xiàn)與其光合參數(shù)的變化同步(圖3-A和C)。因此, 在干旱條件下, PC通過下調(diào)糖組分水平以解除糖對(duì)光合作用的抑制, 并通過氣孔關(guān)閉減緩植株的水分喪失, 從而表現(xiàn)耐旱。外施葡萄糖則通過動(dòng)員糖的分解, 使糖水平恢復(fù), 維持氣孔開度, 增加光合作用底物, 保持光合能力穩(wěn)定, 從而緩解干旱脅迫。有研究認(rèn)為, 可能由于這種反饋抑制(“過度的”蔗糖抑制光合作用)在PC中的敏感性較低(具有C4型PEPC基因有利于更多光合產(chǎn)物的積累), 或者是由于較強(qiáng)的庫源活動(dòng)使蔗糖含量在關(guān)鍵的位點(diǎn)較低[19]。植物細(xì)胞中HXK是糖信號(hào)通路的關(guān)鍵感知因子[18], 糖信號(hào)的關(guān)鍵元件HXK活性在PC中維持很低的水平, 尤其是外施葡萄糖后, 其活性顯著降低, 暗示這些糖組分通過下調(diào)HXK途徑參與干旱響應(yīng)。已有研究顯示, 植物可通過高PEPC酶活性積累更多的糖和有機(jī)酸, 反饋抑制HXK活性[46]。本研究觀察到, 在不同處理下PC的PEPC酶活性均高; 另一方面, 有研究報(bào)道, 在保衛(wèi)細(xì)胞中HXK可感知糖水平, 刺激氣孔關(guān)閉, 協(xié)調(diào)胞內(nèi)糖水平與蒸騰速率, 提高植株水分利用率[47], 本研究也得到類似的結(jié)果。最近在小麥研究中也有類似的發(fā)現(xiàn), 噴施外源T-6-P前體物質(zhì), 可以作為一種糖信號(hào)達(dá)到“生物合成擴(kuò)增”的明顯效果, 顯著提高小麥產(chǎn)量[48]。但PC是否引起T-6-P的變化以參與干旱響應(yīng)仍值得深入研究。值得注意的是, 本研究外施葡萄糖對(duì)水稻不同生育期干旱脅迫的影響有差異, 分析其原因, 初步認(rèn)為噴施葡萄糖可以顯著緩解孕穗期干旱脅迫對(duì)PC造成的產(chǎn)量損失, 可能是孕穗期比分蘗期對(duì)葡萄糖溶液更敏感。本課題組以前的研究結(jié)論, 在整個(gè)生育期都受到干旱脅迫的情況下, PC相比于WT表現(xiàn)出較高的千粒重、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量[9-10]。本研究取得相似的研究結(jié)果, 而且更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 與分蘗期相比, 孕穗期干旱脅迫對(duì)產(chǎn)量影響更顯著, 噴施葡萄糖也在更大程度上緩解PC的干旱脅迫。

信號(hào)分子參與干旱耐性的報(bào)道已有很多, 其中包括Ca2+和NO信號(hào)[49]。本研究中噴施葡萄糖后, 可回調(diào)信號(hào)分子Ca2+含量, 從而消除PC與WT間的差異, 這與Furuichi等[50]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)糖可以誘導(dǎo)Ca2+含量變化的報(bào)道類似。值得關(guān)注的是, 外施葡萄糖顯著上調(diào)了干旱脅迫下PC中NO含量, 暗示外施葡萄糖可以通過上調(diào)NO參與PC的耐旱性。已知NO可以負(fù)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞中脫落酸信號(hào), 是否外施葡萄糖可以通過NO參與PC的ABA信號(hào)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

植物B類鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin B-like, CBL)可以感知Ca2+和糖信號(hào)[51]。CBL蛋白家族本身并沒有激酶活性, 需要通過招募相關(guān)的蛋白激酶形成復(fù)合體來傳遞信號(hào), 這類蛋白質(zhì)稱為CBL相關(guān)蛋白激酶[52]。SnRKs是聯(lián)系糖信號(hào)與脅迫信號(hào)的關(guān)鍵蛋白因子[27], 其中SnRK3具有CBL相關(guān)蛋白激酶功能[53], 通過與感知胞內(nèi)Ca2+信號(hào)和糖信號(hào)的鈣信號(hào)相關(guān)蛋白CBL相互作用, 共同響應(yīng)逆境脅迫[54]。本研究發(fā)現(xiàn), 外施葡萄糖顯著下調(diào)PC的基因以及基因的相對(duì)表達(dá)量。已有研究表明,復(fù)合體是調(diào)控 AKT1 (K+transporter 1, AKT1)的主要蛋白[55], AKT1在保衛(wèi)細(xì)胞中主要調(diào)控K+轉(zhuǎn)運(yùn)。復(fù)合體在調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)于滲透脅迫時(shí)發(fā)揮重要功能, 由于糖信號(hào)引起的糖代謝上的級(jí)聯(lián)放大, 增加了胞質(zhì)溶膠濃度,因此,復(fù)合體基因表達(dá)量下降, 即通過膜下調(diào)滲透作用[56]。本研究外施葡萄糖也是通過下調(diào)上述相關(guān)基因的表達(dá), 維持氣孔的一定開度而響應(yīng)干旱。

綜上所述, 在干旱條件下, PC降低糖組分的含量, 解除高糖對(duì)光合作用的抑制, 并通過氣孔關(guān)閉, 減少植株在干旱條件下的水分喪失, 從而表現(xiàn)耐旱; 而外施葡萄糖則通過動(dòng)員糖的分解, 使糖水平恢復(fù)到正常水平, 維持氣孔一定程度的開度, 增加光合作用底物, 保持光合能力穩(wěn)定, 緩解干旱脅迫, 從而維持產(chǎn)量穩(wěn)定。本研究的結(jié)果將為今后進(jìn)一步從內(nèi)源糖研究PC的耐旱生理機(jī)制,從而揭示更多的糖參與調(diào)節(jié)的信息。

4 結(jié)論

孕穗期噴施葡萄糖聯(lián)合干旱脅迫使PC的株高、每穗實(shí)粒數(shù)、每株實(shí)粒重和單株產(chǎn)量都顯著高于WT。分蘗期噴施葡萄糖聯(lián)合模擬干旱脅迫處理使PC表現(xiàn)出更高的相對(duì)含水量、蔗糖和果糖含量、NO含量以及基因的相對(duì)表達(dá)量, 下調(diào)HXK激酶活性和基因相對(duì)表達(dá)量, 維持一定程度的氣孔開放, 提高干旱脅迫下的光合能力, 從而實(shí)現(xiàn)植株更多的分蘗數(shù)和單株產(chǎn)量。

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Physiological Mechanism on Drought Tolerance Enhanced by Exogenous Glucose in C4-Rice

ZHANG Jin-Fei1, 2, LI Xia1,*, HE Ya-Fei1, 2, and XIE Yin-Feng2

1Institute of Food Crops, Jiangsu Rice Engineering Research Center, National Center for Rice Improvement (Nanjing), Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China

In order to investigate the intrinsic mechanism of glucose participated in drought tolerance in plants, the effects of glucose were studied using the phosphoenolpyruvate carboxylase (C4-) rice (PC) and “Kitaake” (WT) rice lines in pot experiments and hydroponics experiments respectively. The changes of photosynthetic parameters, total soluble sugar and sugar components contents, Ca2+and NO contents, hexokinase activity, transcript levels of sucrose nonfermenting-1(SNF1)-related protein kinases 3 (SnRK3s) and calcitonin B-like (CBL) of the functional leaves in rice lines were measured. Agronomic traits of the wild type (WT) and PC were recorded in the mature period. In pot experiment, the treatment of 3% glucose with drought during tillering stage had no significant effect on agronomic traits of the tested rice. During the booting stage, the plant height, panicle number per plant, filled grain number per panicle and grain yield per plant in PC were significantly higher than in WT (< 0.05). In the hydroponics experiment with 1% glucose combined with 12% (m/v) polyethylene glycol 6000 (PEG-6000) to simulate drought stress, the photosynthetic parameters such as net photosynthetic rate (n), stomatal conductance (s) and carboxylation efficiency (CE) significantly increased in PC than in WT. Similarly, the contents of sucrose and fructose of leaves in PC lines were significantly higher than those in WT. It was noteworthy that hexokinase (HXK) activity and the relative gene expression ofandin PC lines under the treatment with 1% glucose and 12% PEG were significantly lower than those under 12% PEG treatment alone. Intriguingly, the NO contents of PC under the corresponding treatments were significantly increased (< 0.05). In addition, the photosynthetic parameters were significantly correlated with the glucose content, HXK activity andtranscript level respectively in PC lines. It is suggested that PC can decrease the expression ofandgene by increasing glucose, participate the stomatal regulation via NO, maintain relative water content, keep stable photosynthetic capacity, and therefore confer drought tolerance.

rice; glucose; phosphate phosphoenolpyruvate carboxylase; stomatal conductance; drought

2017-03-28;

2017-09-10;

2017-09-28.

10.3724/SP.J.1006.2018.00082

通信作者(Corresponding author): 李霞, E-mail: jspplx@jaas.ac.cn

E-mail: 820788317@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571585), 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(ZX[16]2002)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所基金(LZS17-9)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571585), the Jiangsu Provincial Academy of Agricultural Sciences Basic Research Business Special Project (ZX[16]2002), and the Grant from the Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agri-cultural Sciences (LZS17-9).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170928.1842.022.htm