天牛嗅覺感受相關(guān)蛋白研究進(jìn)展

詹文會(huì)，張?zhí)K芳，耿紅衛(wèi)，王野影，郭 昆，陳 君

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

昆蟲經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選擇進(jìn)化，形成高度特化且靈敏的嗅覺感受系統(tǒng)來(lái)識(shí)別外界環(huán)境中的化學(xué)信息物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化為體內(nèi)電信號(hào)，最終指導(dǎo)昆蟲完成寄主搜尋、尋偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等一系列行為。昆蟲的嗅覺識(shí)別需要多種蛋白質(zhì)參與，主要有氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(Odorant receptors,ORs)、離子型受體(Ionotropic receptors,IRs)、感覺神經(jīng)膜蛋白(Sensory neuron membrane proteins,SNMPs)、氣味降解酶(Odorant-degrading enzymes,ODEs)等。天牛隸屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲總科(Chrysomeloidea)天?？?Cerambycidae)，是鞘翅目中較大的類群之一，為防護(hù)林和經(jīng)濟(jì)林的重要蛀干害蟲，全世界約有45 000種，中國(guó)已知3 100余種[1]。天牛食性雜，寄主廣，繁殖力強(qiáng)，一旦危害，對(duì)園林、果林和防護(hù)林有毀滅性危害。在天牛生活史中，幼蟲期所占時(shí)間最長(zhǎng)，活動(dòng)隱蔽，防治困難，而成蟲是天牛裸露活動(dòng)的蟲態(tài)，因此成為防治的最佳階段。目前，基于天牛成蟲與寄主植物之間化學(xué)信息聯(lián)系的化學(xué)生態(tài)研究，已成為天牛防治新途徑的研究熱點(diǎn)。諸多研究表明，天牛的嗅覺在利用寄主植物釋放的揮發(fā)性次生物質(zhì)識(shí)別寄主的過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用。綜述了近年來(lái)天牛嗅覺相關(guān)蛋白研究進(jìn)展，為基于嗅覺調(diào)控的環(huán)境友好型害蟲防治新技術(shù)的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供依據(jù)。

1 天牛嗅覺感器

嗅覺感器是昆蟲感知周圍環(huán)境中各種化學(xué)物質(zhì)的重要基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，主要分布在昆蟲觸角上。天牛成蟲觸角為絲狀，共11節(jié)(個(gè)別種類12節(jié))，由柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)三部分構(gòu)成，其中鞭節(jié)分為9亞節(jié)。天牛觸角上分布的感器主要包括刺形感器、錐形感器、B?hm氏鬃毛、凹槽丁形感器和鐘形感器[2-5]，其中錐形感器通常壁很薄且表面具孔，因此被推斷為嗅覺感器。錐形感器在天牛科種類間形態(tài)變化較大，這種形態(tài)差異可能是識(shí)別不同寄主植物和環(huán)境中的信息化合物所導(dǎo)致。在黃星天牛(Psacotheahilaris)[6]、松褐天牛(Monochamusalternatus)[7]、曲紋花天牛(Lepturaarcuata)、橡黑花天牛(Lepturaaethiops)[8]和咖啡脊虎天牛(Xylotrechusgrayii)[5]等種類中均發(fā)現(xiàn)錐形感器在鞭節(jié)末端是成簇分布的，這種成簇分布的嗅覺感器增強(qiáng)了嗅覺感受功能并有助于長(zhǎng)距離嗅覺分子的識(shí)別[9]。錐形感器不僅是一種嗅覺受體，在有些種類的天牛中還存在性二型現(xiàn)象，可能與性信息素的識(shí)別有關(guān)。如在曲紋花天牛和橡黑花天牛中均發(fā)現(xiàn)雄性個(gè)體錐形感器的數(shù)量顯著高于雌性，據(jù)此推斷雄性錐形感器具有感受雌性個(gè)體釋放的性信息素的功能[8]。

2 天牛嗅覺相關(guān)蛋白

相對(duì)于鱗翅目、膜翅目等類群，鞘翅目類群的嗅覺相關(guān)蛋白研究起步較晚。僅有大猿葉甲[10]、云南切梢小蠹[11]、紅酯大小蠹[12]、黃粉蟲[13]、花絨寄甲[14]、赤擬谷盜[15]、云杉八齒小蠹、中歐山松大小蠹[16]等十幾種鞘翅目昆蟲的嗅覺基因得到發(fā)掘和驗(yàn)證；而在天?？评ハx中，目前僅對(duì)光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)、云斑天牛(Batocerahorsfieldi)和松褐天牛等少數(shù)物種的嗅覺相關(guān)基因進(jìn)行鑒定。

2.1 氣味結(jié)合蛋白

嗅覺感受神經(jīng)元存在于嗅覺感器內(nèi)親水性的淋巴液中，而昆蟲感受的氣味物質(zhì)多為脂溶性的小分子化合物，因此這些小分子物質(zhì)最先與氣味結(jié)合蛋白結(jié)合，使其穿過(guò)親水性的淋巴液到達(dá)嗅覺神經(jīng)樹突膜上的氣味受體，最終引起昆蟲一系列行為。氣味結(jié)合蛋白是一類可溶性胞外蛋白[17]，作為脂溶性氣味分子的載體，由120～150個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為14～17 ku，等電點(diǎn)為4～5，N端有一段20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。二級(jí)結(jié)構(gòu)由6個(gè)α螺旋構(gòu)成多維二聚體，有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，形成3個(gè)相互交連的二硫鍵。根據(jù)序列中保守半胱氨酸殘基數(shù)目和位點(diǎn)特征，OBPs分為Classic OBPs、Plus-C OBPs、Minus-C OBPs、非典型的OBPs等[18-19]。其中Classic OBPs又包含PBPs、GOBPs和ABPx。迄今，天?？浦挥袦项i天牛亞科4個(gè)種的OBPs被報(bào)道。

光肩星天牛是首個(gè)被報(bào)道OBPs的天牛種類，也是天?？莆ㄒ槐粶y(cè)定基因組的物種。王偉[20]利用mRNA差異顯示體系(DDRT-PCR)得到了光肩星天牛2個(gè)氣味結(jié)合蛋白AglaOBP1和AglaOBP2的全長(zhǎng)序列。李慧恩等[21]通過(guò)構(gòu)建光肩星天牛觸角全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)并結(jié)合表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)分析，得到4條氣味結(jié)合蛋白全長(zhǎng)序列。Hu等[22]在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定了42個(gè)OBPs基因，其中23個(gè)基因的N端編碼一段信號(hào)肽，開放閱讀框超過(guò)400 bp。根據(jù)OBPs半胱氨酸位置特征，鑒定出16個(gè)Minus-C OBPs基因、2個(gè)PBPs基因。其中，PBPs在觸角中高表達(dá)，尤其是AglaPBP2特異性表達(dá)于觸角，表達(dá)量是其他組織的200倍，說(shuō)明觸角是信息素的主要識(shí)別位點(diǎn)，AglaPBP2在性信息素識(shí)別中起重要作用。McKenna等[23]完成了光肩星天牛的基因組測(cè)定，注釋了52個(gè)OBPs，包括31個(gè)Minus-C OBPs、20個(gè)Classic OBPs和1個(gè)Plus-C OBPs, 相對(duì)于其他已測(cè)定基因組序列的物種，光肩星天牛的Minus-C亞家族明顯擴(kuò)張。

通過(guò)構(gòu)建云斑天牛的cDNA文庫(kù)和采用EST測(cè)序技術(shù)得到3個(gè)OBPs(BhorOBP1、BhorOBP2、BhorOBP3)、2個(gè)PBPs(BhorPBP1、BhorPBP2)和4個(gè)Minus-C OBPs的序列，并克隆了3個(gè)OBPs[24]和4個(gè)Minus-C OBPs[25]的基因。半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，云斑天牛OBP1—3和Minus-C OBP1—3在頭部(去除觸角和下顎須、下唇須)均不表達(dá),而在觸角、下顎須、下唇須、翅、足和腹部均有表達(dá)，Minus-C OBP4在觸角、翅、足、腹部有表達(dá)；定量PCR顯示，3個(gè)OBPs基因在觸角的表達(dá)量最高，無(wú)論交配與否OBPs在雄蟲不同組織的表達(dá)量高于雌蟲，在羽化后1～5 d以及羽化后30 d左右，OBPs的表達(dá)量遠(yuǎn)高于中間時(shí)期的表達(dá)量[24]。Minus-C OBPs在云斑天牛整個(gè)生活史中都表達(dá)，與OBPs相反，無(wú)論交配與否雌蟲的表達(dá)量均高于雄蟲[25]。各種氣味結(jié)合蛋白在雌、雄蟲中及不同時(shí)期表達(dá)量存在差異，表明OBPs在雄蟲尋找配偶和雌蟲尋找補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)寄主及產(chǎn)卵場(chǎng)所的過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。對(duì)氣味結(jié)合蛋白BhorOBP2進(jìn)行原核表達(dá)、純化，并利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)其與云斑天牛寄主揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)BhorOBP2與反-2-己烯醛、2-丁基丁醛、水楊醛、馬鞭草烯酮、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、β蒎烯、乙酸乙酯等結(jié)合能力強(qiáng)，推測(cè)BhorOBP2與鏈?zhǔn)交衔镉休^強(qiáng)的結(jié)合能力，同時(shí)結(jié)合能力受化合物碳鏈長(zhǎng)度影響[24,26]。BhorOBP2與大多數(shù)的寄主揮發(fā)物有較好的結(jié)合特性，因此，推測(cè)BhorOBP2在云斑天牛寄主定位過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。通過(guò)分子建模和對(duì)接試驗(yàn)檢測(cè)BhorOBPm2和化合物的作用機(jī)制，BhorOBPm2因缺少1對(duì)二硫鍵而有更大的彈性、更大的結(jié)合腔和更多的配基特異性結(jié)合，因此認(rèn)為Minus-C OBPs提供了OBPs進(jìn)化過(guò)程中的中間結(jié)構(gòu)[27]。除了克隆、表達(dá)后驗(yàn)證OBPs的功能外，卓志航等[28]從云斑天?？偟鞍字刑峒儾⑦M(jìn)行葡聚糖凝膠G75層析分離，獲得云斑天牛觸角中的一種蛋白，該蛋白pur-pro.I與熒光探針1-NPN發(fā)生熒光結(jié)合反應(yīng)，證明其為云斑天牛的一種氣味結(jié)合蛋白。

松褐天牛有31個(gè)OBPs。高雄等[29-30]通過(guò)構(gòu)建松褐天牛cDNA文庫(kù)，克隆了4個(gè)OBPs基因(MaltOBP2—5)。Wang等[14]通過(guò)測(cè)定松褐天牛成蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組，得到了25個(gè)OBPs基因(MaltOBP5—29)的序列,其中全長(zhǎng)基因21個(gè)，并克隆了5個(gè)OBPs基因。隨后錢凱等[31]克隆了2個(gè)OBPs基因即MaltOBP2和MaltOBP6，其中MaltOBP2與高雄[29]克隆的MaltOBP2基因序列相同。李娜[32]克隆了9個(gè)MaltOBPs基因全長(zhǎng)，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，松褐天牛OBPs基因在不同發(fā)育時(shí)間和不同組織間表達(dá)量有明顯差異，且其表達(dá)量受性別和交尾狀態(tài)的影響，例如MaltOBP7主要表達(dá)于松褐天牛成蟲足中且在雌蟲中表達(dá)量較雄蟲高；MaltOBP12和MaltOBP15基因在交配后雌蟲中的表達(dá)量顯著高于未交配雌蟲，這可能與雌蟲交配后尋找產(chǎn)卵場(chǎng)所有關(guān)。昆蟲嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)在其生存和繁殖中起著很重要的作用。MaltOBP9和MaltOBP10基因分別在羽化5 d雌蟲和雄蟲的下唇須和下顎須中高表達(dá)，可能與下顎須和下唇須密布嗅覺感受器，行使重要的嗅覺感受功能有關(guān)[33]。MaltOBP13和MaltOBP19分別于雄蟲和羽化5 d雌蟲腹末3節(jié)中高表達(dá)[32-33]，表明其與昆蟲性成熟有關(guān)，不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量和天牛行為相關(guān)，松褐天牛嗅覺相關(guān)蛋白在羽化0 d高表達(dá)可能與尋找食物有關(guān)，5 d或13 d高表達(dá)可能與尋找配偶、產(chǎn)卵場(chǎng)所等行為有關(guān)。松褐天牛雄蟲中，MaltOBP7、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP18、MaltOBP20 基因在羽化0 d有較高的表達(dá)量，可能與其取食行為有關(guān)，這種取食行為有利于其達(dá)到性成熟[34]。MaltOBP24在1 d雌蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期觸角中的表達(dá)量，可能與初羽化的寄主定位行為有關(guān)；MaltOBP21在13 d已交配雌蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期觸角中的表達(dá)量，可能與成蟲的生物學(xué)特性有關(guān)。松褐天牛成蟲在識(shí)別寄主揮發(fā)物過(guò)程中雌、雄間存在差異，大部分氣味結(jié)合蛋白基因在雄蟲中的表達(dá)量高于雌蟲中的表達(dá)量，雄蟲比雌蟲更容易識(shí)別寄主和尋找配偶等[35]。綜上所述，對(duì)松褐天牛OBPs表達(dá)量的研究有助于預(yù)測(cè)OBPs在天牛行為中的作用。天牛嗅覺蛋白的研究主要集中在成蟲階段，而錢凱等[31]研究了MaltOBP2和MaltOBP6在松褐天牛不同發(fā)育階段的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)MaltOBP2 在蛹觸角中的表達(dá)量最高，在成蟲觸角中的表達(dá)量最低，而MaltOBP6 在幼蟲頭部的表達(dá)量最高。通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定其他8個(gè)蛋白與寄主植物揮發(fā)物單體的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)MaltOBP3(Classic)和MaltOBP5(Minus)與檸檬烯氧化物等5種化合物均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其中對(duì)(-)-檸檬烯結(jié)合能力最強(qiáng)，另外，MaltOBP3對(duì)a-異松油稀等6種化合物、MaltOBP5對(duì)R-(-)-檸檬烯和 (+)-a-蒎烯分別有較強(qiáng)的結(jié)合力[29]。王娟[33]測(cè)定了Minus-C亞家族的MaltOBP9和MaltOBP21，Classic亞家族的MaltOBP10，Plus-C亞家族MaltOBP19和MaltOBP24在中性和酸性環(huán)境下與18種松樹揮發(fā)物單體的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谥行原h(huán)境下與揮發(fā)物的結(jié)合能力普遍高于酸性環(huán)境。在中性條件下，MaltOBP9和MaltBOP21對(duì)其中β-石竹烯等4種揮發(fā)物都有較強(qiáng)的結(jié)合能力，而MaltOBP19和MaltOBP24結(jié)合特性方面表現(xiàn)出比較大的差異，其中MaltOBP19對(duì)17種揮發(fā)物均表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合力，而MaltOBP24僅對(duì)3-蒈烯等5種揮發(fā)物表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合力。而屬于Classic OBPs的MaltOBP13蛋白在酸性條件下與寄主揮發(fā)物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力明顯高于中性條件。無(wú)論在酸性還是中性條件下，MaltOBP13對(duì)丁羥基甲苯均具有較強(qiáng)的結(jié)合特性。在酸性條件下，除與崁酮、莰烯、(+)-長(zhǎng)葉環(huán)烯結(jié)合能力相對(duì)較弱外，與其他物質(zhì)均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。在中性條件下，與S-(-)-檸檬烯等9種化合物結(jié)合能力很強(qiáng)，其中，與丁羥基甲苯結(jié)合能力最強(qiáng)，與(+)-檸檬烯氧化物等7種化合物結(jié)合能力較弱[36]。不同氣味結(jié)合蛋白對(duì)化合物有明顯的特異性識(shí)別，說(shuō)明它們參與寄主識(shí)別。

李廣偉等[37]通過(guò)測(cè)定黃斑星天牛(Anoplophoranobilis)雌蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組，共鑒定到16個(gè)OBPs基因，包括11個(gè)Minus-C OBPs、3個(gè)Classic OBPs和2個(gè)Plus-C OBPs。半定量PCR研究表明，OBPs基因在各個(gè)組織中都有表達(dá)。與鱗翅目昆蟲相比，天牛等鞘翅目昆蟲觸角中分布著更多的Minus-C OBPs。許多研究表明，Minus-C OBPs更多存在于較為原始的物種中，推測(cè)Minus-C類型是OBPs家族的祖先類型，昆蟲OBPs隨著物種進(jìn)化，產(chǎn)生更多半胱氨酸殘基形成二硫鍵來(lái)穩(wěn)定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，有利于蛋白質(zhì)與氣味分子的特異性識(shí)別[38]。

2.2 化學(xué)感受蛋白

昆蟲嗅覺感器內(nèi)淋巴液中除了氣味結(jié)合蛋白，還有另一類水溶性蛋白化學(xué)感受蛋白，它與氣味結(jié)合蛋白具有類似功能，1994年首次在黑腹果蠅觸角中被發(fā)現(xiàn)[39]。該類蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為10～15 ku，由100～120個(gè)氨基酸組成，N端有17～25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。典型特征是具有4個(gè)保守半胱氨酸殘基，且形成2對(duì)二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其在昆蟲中同源性很高，表達(dá)分布部位為觸角、性腺、下唇須、足等。Wang等[14]通過(guò)構(gòu)建松褐天牛轉(zhuǎn)錄組，鑒定12個(gè)CSPs轉(zhuǎn)錄本，其中8個(gè)為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。李慧等[24,40]通過(guò)測(cè)定云斑天牛觸角得到3個(gè)化學(xué)感受蛋白基因，且3個(gè)基因在云斑天牛組織中廣泛分布，說(shuō)明化學(xué)感受蛋白具有多種功能。除下唇須和下顎須外的其他組織中，無(wú)論交尾與否雄蟲BhorCSPs的表達(dá)量均顯著高于雌蟲。在不同發(fā)育時(shí)期，雌蟲的表達(dá)量變化較小而雄蟲變化較大，在大部分時(shí)期交尾后雄蟲的表達(dá)量最高。交尾后雌蟲在羽化后5 d和20～25 d時(shí)間段BhorCSPs表達(dá)量較高，推測(cè)CSPs在云斑天牛尋找寄主補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和尋找產(chǎn)卵場(chǎng)所過(guò)程中有一定作用。雄蟲BhorCSPs的表達(dá)量在翅中變化最大，未交尾雄蟲在羽化10 d或者15 d表達(dá)量最高，交尾雄蟲在10 d或者30 d表達(dá)量最高。在整個(gè)發(fā)育時(shí)期BhorCSPs的表達(dá)模式非常復(fù)雜，各基因間不同的表達(dá)模式說(shuō)明化學(xué)感受蛋白具有多種功能。王偉[20]利用DDRT-PCR技術(shù)得到了光肩星天牛AglaCSP1基因，并對(duì)該蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。Hu等[22]在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定12個(gè)CSPs基因，均具有完整的ORF，除CSP4外，其他基因N末端有信號(hào)肽。這12個(gè)CSPs基因分別在觸角、下唇須、下顎須和足等多種組織中高表達(dá)，且包括非感受組織，說(shuō)明其功能具有多樣性。

2.3 氣味受體

昆蟲的氣味受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族，有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，且具有與脊椎動(dòng)物相反的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[41]。同時(shí)與OBPs和CSPs相比，昆蟲間的ORs高度分化，使得其鑒定難度加大，需要借助基因組的測(cè)序工作。直到1999年，在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)了昆蟲的第1個(gè)OR[42]，隨后又在多種昆蟲中鑒定出各自的ORs。昆蟲的氣味受體位于嗅覺神經(jīng)元樹突膜上，一般大約由400個(gè)氨基酸組成，而且多數(shù)氣味受體神經(jīng)元表達(dá)2類不同的受體：一類是共受體OR83b，該類受體數(shù)量少，不直接參與感知?dú)馕斗肿?，具有高度保守的特性，Orco屬于此類受體；另一類是傳統(tǒng)受體ORs，此類受體又稱普通氣味受體，數(shù)量多，且保守性低。

目前，ORs在許多鱗翅目、膜翅目昆蟲中的研究較多，而在鞘翅目昆蟲中的研究較少，第1個(gè)被報(bào)道ORs的天牛科物種是胡桃縊虎天牛(Megacyllenecaryae)。Mitchell等[43]測(cè)定了胡桃縊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組，獲得了57個(gè)ORs基因序列，其中包括30個(gè)全長(zhǎng)ORs基因、26個(gè)部分序列和1個(gè)Orco基因。為檢測(cè)ORs基因的功能，將9個(gè)ORs基因克隆并轉(zhuǎn)入pGEMHE載體在爪蛙卵母細(xì)胞共表達(dá)，然后選擇雄性天牛成蟲產(chǎn)生的9種信息素作為供試配體化合物，結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)對(duì)ORs基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定McaOR3對(duì)(S)-2-甲基-1-丁醇敏感，McaOR20對(duì)(2S,3R)-2,3-己二醇敏感，McaOR5對(duì)2-苯乙醇敏感。并且發(fā)現(xiàn)McaOR3和McaOR20對(duì)其他天牛的相似信息素也敏感，說(shuō)明同源受體也存在于其他天牛物種中。Wang等[14,33]通過(guò)構(gòu)建松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組得到8條ORs片段序列和1條全長(zhǎng)序列MaltOR1，后者編碼451個(gè)氨基酸。在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定37個(gè)ORs，其中7個(gè)為全長(zhǎng)基因，系統(tǒng)發(fā)育樹中大多數(shù)ORs聚在多條分支，這表明該受體蛋白保守性低，保證天牛嗅覺系統(tǒng)的特異性。光肩星天牛AglaOR9與1個(gè)家蠶、5個(gè)鞘翅目昆蟲和1個(gè)西方蜜蜂Orco基因聚在一支，說(shuō)明Orco基因在不同種屬之間保守性比OR基因高，因此可判定AglaOR9為光肩星天牛的共受體基因[22]。氣味受體作為將外界化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)最終引起昆蟲行為反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，其具體功能有待進(jìn)一步探討。從光肩星天?；蚪M中鑒定132個(gè)ORs基因，包括1個(gè)Orco基因、120個(gè)ORs基因、11個(gè)ORs假基因，其中3個(gè)ORs基因在雌蟲中高表達(dá)，1個(gè)ORs基因在雄蟲中高表達(dá)，這些受體功能未知，可根據(jù)其他天牛的受體基因進(jìn)行推測(cè)，如將AglaOR29、AglaOR35—36和AglaOR65—68分別與胡桃縊虎天牛的McarOR3、McarOR5和McarOR20[23,44]相比進(jìn)行推測(cè)，后者的功能已被驗(yàn)證。

2.4 其他嗅覺相關(guān)蛋白

除了上述的3類蛋白質(zhì)外，人們對(duì)參與昆蟲嗅覺識(shí)別的離子型受體、感覺神經(jīng)膜蛋白、氣味降解酶等蛋白質(zhì)的研究較少。目前有少數(shù)文獻(xiàn)進(jìn)行了基因鑒定，如Hu等[22]通過(guò)對(duì)光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組研究獲得1條ODE、14條PDEs(Pheromone-degrading enzymes)、4條IRs和2條SNMPs基因序列，通過(guò)對(duì)光肩星天牛的基因組研究得到72條IRs基因序列；Wang等[14]通過(guò)測(cè)定分析松褐天牛觸角的轉(zhuǎn)錄組，得到了1條SNMPs基因全長(zhǎng)序列。但是這些基因的功能目前在天牛中還未見報(bào)道。

3 展望

目前對(duì)鞘翅目中嗅覺蛋白的研究只報(bào)道了12個(gè)種，天牛科中報(bào)道了5個(gè)種，僅赤擬谷盜和光肩星天牛等個(gè)別物種大部分嗅覺蛋白家族有系統(tǒng)報(bào)道，多數(shù)物種只研究了1個(gè)或幾個(gè)蛋白家族甚至只報(bào)道了個(gè)別基因序列。由于物種和序列的局限性，不能做整個(gè)嗅覺蛋白家族的進(jìn)化分析，無(wú)法將OBPs等進(jìn)一步區(qū)分到型，鞘翅目作為昆蟲綱最大的目，更多物種的嗅覺基因需要鑒定，這對(duì)于整個(gè)昆蟲綱嗅覺蛋白的進(jìn)化研究具有重要意義。另外，與鱗翅目等其他昆蟲類群相比，天牛嗅覺基因的功能研究采用的方法單一，僅利用生化指標(biāo)及原核表達(dá)純化蛋白等途徑來(lái)研究蛋白質(zhì)功能，而通過(guò)RNA干擾或基因敲除等手段觀察昆蟲行為來(lái)研究基因功能的報(bào)道很少，是未來(lái)需要進(jìn)一步拓展的方向之一。

參考文獻(xiàn):

[1] 張健.吉林省天牛科昆蟲分類學(xué)研究[D].長(zhǎng)春:東北師范大學(xué),2011.

[2] 熊賽.天牛亞科虎天牛族頭部和跗節(jié)超微形態(tài)研究[D].重慶:西南大學(xué),2014.

[3] 熊賽,何思瑤,李竹,等.桔褐天牛頭部附器感器的掃描電鏡觀察[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,36(5):36-45.

[4] 張健,張曉軍,馬麗濱,等.楔天牛屬2種天牛觸角感器掃描電鏡觀察[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(2):93-101.

[5] Chen J M,Qiao H L,Chen J,etal.Observation of antennal sensilla inXylotrechusgrayii(Coleoptera: Cerambycidae) with scanning electron microscopy[J]. Microscopy Research and Technique, 2014,77(4): 264-273.

[6] Dai H G,Honda H.Sensilla on the antennal flagellum of the yellow spotted longicorn beetle,Psacotheahilaris(PASCOE)(Coleoptera: Cerambycidae)[J]. Applied Entomology & Zoology, 1990, 25(2):273-282.

[7] Sun F,Li X R,Liu X X,etal.Ultrastructure of six types of antennal sensilla inMonochamusalternatus[J]. Chinese Bulletin of Entomology, 2010, 47(2): 347-354.

[8] Zhang J,Guan L,Ren B.Fine structure and distribution of antennal sensilla of longicorn beetlesLepturaarcuataandLepturaaethiops(Coleoptera: Cerambycidae)[J].Annals of the Entomological Society of America, 2011,104(4): 778-787.

[9] Inouchi J,Shibuya T,Matsuzaki O,etal.Distribution and fine structure of antennal olfactory sensilla in Japanese dung beetles,GeotrupesauratusMtos.(Coleoptera:Geotrupidae) andCoprispecuariusLew. (Coleoptera: Scarabaeidae)[J]. International Journal of Insect Morphology & Embryology, 1987, 16(2): 177-187.

[10] Li X M,Zhu X Y,Wang Z Q,etal.Candidate chemosensory genes identified inColaphellusbowringiby antennal transcriptome analysis[J]. BMC Genomics, 2015,16(1):1028.doi:10.1186/s12864-015-2236-3.

[11] Zhu J Y,Zhao N,Yang B.Global transcriptional analysis of olfactory genes in the head of pine shoot beetle,Tomicusyunnanensis[J]. Comparative and Functional Genomics,2012,2012:1-10.doi:10.1155/2012/491748.

[12] Gu X C,Zhang Y N,Kang K,etal.Antennal transcriptome analysis of odorant reception genes in the red turpentine beetle (RTB),Dendroctonusvalens[J]. PLoS ONE, 2015,10(5): e0125159.

[13] Liu S, Rao X J,Li M Y,etal.Identification of candidate chemosensory genes in the antennal transcriptome ofTenebriomolitor(Coleoptera: Tenebrionidae)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology(Part D: Genomics and Proteomics), 2015, 13: 44-51.

[14] Wang J,Li D Z,Min S F,etal.Analysis of chemosensory gene families in the beetleMonochamusalternatusand its parasitoidDastarcushelophoroides[J].Comparative Biochemistry and Physiology(Part D: Genomics and Proteomics), 2014,11(9): 1-8.

[15] Engsontia P,Sanderson A P,Cobb M,etal.The red flour beetle’s large nose: An expanded odorant receptor gene family inTriboliumcastaneum[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 38(4): 387-397.

[16] Andersson M N,Grosse W E,Keeling C I,etal.Antennal transcriptome analysis of the chemosensory gene families in the tree killing bark beetles,IpstypographusandDendroctonusponderosae(Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae)[J]. BMC Genomics,2013,14(1): 198.doi:10.1186/1471-2164-14-198.

[17] Pelosi P,Zhou J J,Ban L P,etal.Soluble proteins in insect chemical communication[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2006,63(14): 1658-1676.

[18] Xu P X,Zwiebel L J,Smith D P.Identification of a distinct family of genes encoding atypical odorant-binding proteins in the malaria vector mosquito,Anophelesgambiae[J]. Insect Molecular Biology, 2003,12(6): 549-560.

[19] Zheng W W,Peng W,Zhu C P,etal.Identification and expression profile analysis of odorant binding proteins in the oriental fruit flyBactroceradorsalis[J]. International Journal of Molecular Sciences,2013,14(7): 14936-14949.

[20] 王偉.光肩星天牛觸角嗅覺相關(guān)蛋白基因的鑒別與克隆[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

[21] 李慧恩,王志剛,沈騰維,等.光肩星天牛觸角cDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,44(11):96-99.

[22] Hu P, Wang J Z,Cui M M,etal.Antennal transcriptome analysis of the Asian longhorned beetleAnoplophoraglabripennis[J]. Scientific Reports,2016, 6: 26652.doi:10.1038/srep26652.

[23] McKenna D D,Scully E D,Pauchet Y,etal.Genome of the Asian longhorned beetle(Anoplophoraglabripennis), a globally significant invasive species, reveals key functional and evolutionary innovations at the beetle-plant interface[J]. Genome Biology, 2016, 17(1):227.

[24] 李慧.云斑天牛觸角cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及相關(guān)嗅覺蛋白的表達(dá)及功能分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[25] Li H,Zhang A J,Chen L Z,etal. Construction and analysis of cDNA libraries from the antennae ofBatocerahorsfieldiand expression pattern of putative odorant binding proteins[J]. Journal of Insect Science, 2014, 14(1): 57.

[26] 潘翔宇.云斑天牛性信息素分離鑒定及氣味結(jié)合蛋白結(jié)合特性分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[27] Zheng Z C,Li D Z,Zhou A M,etal.Predicted structure of a Minus-C OBP fromBatocerahorsfieldi(Hope) suggests an intermediate structure in evolution of OBPs[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1):33981.doi:10.1038/srep33981.

[28] 卓志航,楊偉,徐丹萍,等.一種云斑天牛氣味結(jié)合蛋白的分離純化[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016,40(4): 164-170.

[29] 高雄.松褐天牛OBPs基因克隆與分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[30] Gao X,Wang M Q.A cDNA library from the antenna ofMonochamusalternatusHope and binding properties of odorant-binding proteins[J]. Journal of Applied Entomology, 2015,139(3): 229-236.

[31] 錢凱,馮波,巫詡亮,等.松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及組織表達(dá)譜和原核表達(dá)研究[J].昆蟲學(xué)報(bào),2015,58(5):496-506.

[32] 李娜.松褐天牛氣味結(jié)合蛋白基因克隆與分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[33] 王娟.松褐天牛氣味結(jié)合蛋白基因的克隆與功能分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[34] Wingfield M J,Blanchette R A.The pine-wood nematode,Bursaphelenchusxylophilus, in Minnesota and Wisconsin: Insect associates and transmission studies[J]. Canadian Journal of Forest Research, 1983, 13(6): 1068-1076.

[35] Fan J T,Kang L,Sun J H.Role of host volatiles in mate location by the Japanese pine sawyer,MonochamusalternatusHope (Coleoptera: Cerambycidae)[J]. Environmental Entomology,2007, 36(1): 58-63.

[36] Li N,Sun X,Wang M Q. Expression pattern and ligand-binding properties of odorant-binding protein 13 fromMonochamusalternatesHope [J]. Journal of Applied Entomology, 2017, 141(9): 751-757.

[37] 李廣偉,陳秀琳,尚天翠.黃斑星天牛雌蟲觸角氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定及組織分布[J].生態(tài)學(xué)雜志,2017,36(6):1-12.

[38] Vieira F G, Rozas J.Comparative genomics of the odorant-binding and chemosensory protein gene families across the Arthropoda: Origin and evolutionary history of the chemosensory system[J]. Genome Biology and Evolution, 2011,3(1): 476-490.

[39] Mckenna M P,Hekmat-Scafe D S,Gaines P,etal.PutativeDrosophilapheromone-binding proteins expressed in a subregion of the olfactory system[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(23): 16340-16347.

[40] Li H,Zhang G,Wang M.Chemosensory protein genes ofBatocerahorsfieldi(Hope): Identification and expression pattern[J]. Journal of Applied Entomology, 2012,136(10): 781-792.

[41] Benton R,Sachese S,Michnick S W,etal.Atypical membrane topology and heteromeric function ofDrosophilaodorant receptorsinvivo[J]. PLoS Biology, 2006,4(2): 240-257.

[42] Pennisi E. Fruit fly odor receptors found[J]. Science, 1999,283(5406): 1239.

[43] Mitchell R F,Hughes D T,Luetje C W,etal.Sequencing and characterizing odorant receptors of the cerambycid beetleMegacyllenecaryae[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology, 2012,42(7): 499-505.

[44] Mitchell R F,Hall L P,Reagel P F,etal.Odorant receptors and antennal lobe morphology offer a new approach to understanding olfaction in the Asian longhorned beetle[J]. Journal of Comparative Physiology A, 2017,203(2): 99-109.