觀賞植物抗蚜蟲新途徑分析

楊振立，李 旸，吳志明，蔣楚燕，董文琦*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

蚜蟲是繁殖最快的昆蟲，在地球上為害作物廣泛，還是植物病原體的傳播介體（占已知傳播病毒昆蟲種類的45.8%[1]），其分泌物是人類呼吸道主要的過敏源，嚴(yán)重破壞城鄉(xiāng)生活環(huán)境。蚜蟲較難防治，主要原因在于其防御機(jī)制：有的種類能夠分泌植物激素，使植物形成癭瘤巢；有的分泌一層蠟質(zhì)覆蓋于體表，令藥物難以滲入；有的釋放強(qiáng)烈的芥末油氣味，嚇跑天敵[2]。

園林景觀和城鄉(xiāng)綠地是人群較為集中的地方，當(dāng)前在防治蚜蟲過程中常使用化學(xué)藥劑噴霧法[3]。而化學(xué)噴霧法雖然見效快，但副作用明顯，尤其是污染環(huán)境后對(duì)人和動(dòng)物身體健康都有不利影響。對(duì)于非食用的觀賞植物，我們可以選擇轉(zhuǎn)基因的抗蚜途徑。相關(guān)研究主要集中在抗蚜基因、抗蚜資源和抗蚜生物藥劑等方面。

1 植物抗蚜的研究現(xiàn)狀

1.1 抗蚜基因克隆

抗蚜資源多存在于野生種或近源種中[4]。國(guó)外研究顯示，在3 500個(gè)大豆種質(zhì)中僅篩選到11個(gè)抗源[5]，在1 200個(gè)萵苣種質(zhì)中篩選到2個(gè)抗源[6]，在4萬(wàn)個(gè)小麥資源中僅300個(gè)表現(xiàn)抗性[7]。植物對(duì)昆蟲的抗性一般可分為驅(qū)避性、抗生性和耐害性3種類型，其中抗生性作用最明顯，又包括多基因控制和單顯（隱）基因控制，如小麥對(duì)麥雙尾蚜（Diuraphis noxia Mordvilko） 的抗性、大豆對(duì)大豆蚜（Aphis glycines Matsumura） 的抗性是單顯基因控制[8]；但在小麥和大麥中也發(fā)現(xiàn)了用于對(duì)付豌豆蚜（Acythosiphon pisum Harris）、玉米蚜 （Rhopalosiphum maidis Fitch） 的隱性抗蚜基因，數(shù)量性狀控制的抗性更多[9]。理論上只有單顯基因控制的抗性才有利于通過基因克隆和轉(zhuǎn)化應(yīng)用于其他物種上，而更多的資源適用于本作物的遠(yuǎn)源雜交或常規(guī)育種。隨著植物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，分離克隆抗蚜基因的能力日益增強(qiáng)[10]，一些抗蚜基因被克隆出來(lái)，如Mi-1可抗大戟長(zhǎng)管蚜（Macrosiphum euphorbiae）[11]、Vat可抗甜瓜棉蚜（Aphis gossypii Glover）[12]，這類抗蚜基因一般與植物超敏反應(yīng)有關(guān)，即對(duì)應(yīng)植物能識(shí)別被蚜蟲入侵的信號(hào)，以合成酚類物質(zhì)、在細(xì)胞壁上沉積胼胝質(zhì)或木質(zhì)素等方式對(duì)抗蚜蟲。目前雖然已有抗蚜基因被克隆，但是蚜蟲種類很多，而一種基因可抗的蚜蟲種類過少，因此，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足園藝上生物防治的需要。

1.2 高抗蚜資源挖掘

掌葉半夏是一種天然高抗蚜、無(wú)特殊味道的中草藥，從20世紀(jì)90年代起人們嘗試分離半夏的抗蟲活性物質(zhì)，初步研究后認(rèn)為主要作用是由植物凝集素形成的，河北省農(nóng)林科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)從中克隆出了PPA-1、PTA-1等多個(gè)基因[13]。凝集素的抗蟲活性依賴與糖結(jié)合，而糖鏈很難利用轉(zhuǎn)基因的方式進(jìn)行正確表達(dá)[14]。2010年范漢東等[15]從半夏塊莖總蛋白中發(fā)現(xiàn)了新的抗蚜活性物質(zhì)，該物質(zhì)屬于植物胰蛋白酶抑制劑（Pinellia peatisecta trypsin inhibitor，以下稱PPTI蛋白或PPTI基因） 類型，濃度達(dá)到0.5%時(shí)5 d后蚜蟲的校正死亡率達(dá)到100%。更為重要的是經(jīng)SDSPAGE、反相高效液相色譜測(cè)算該物質(zhì)為不含糖的純蛋白，質(zhì)譜分析顯示其相對(duì)分子量為20 596.09。PPTI蛋白與其它種類抗蟲活性蛋白相比具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)[16，17]：（1） 其是純蛋白質(zhì)作用的結(jié)果，相較于依賴與糖結(jié)合的凝聚素家族，基因更容易構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，應(yīng)用植物范圍廣；（2）蛋白酶抑制劑一般具有更廣譜的抗蟲性，因此推測(cè)PPTI蛋白對(duì)多種蚜蟲會(huì)有抗性；（3）昆蟲不易產(chǎn)生對(duì)蛋白抑制劑的耐受性。人們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在掌葉半夏葉片部位可由機(jī)械損傷和病蟲侵入誘導(dǎo)高濃度表達(dá)此類蛋白。

1.3 蛋白酶抑制劑研究

前人對(duì)此已有很多研究，如達(dá)克東等[18]和周瑞蘇等[19]系統(tǒng)研究了用豇豆CpTI轉(zhuǎn)化蘋果，60個(gè)轉(zhuǎn)化株系中有2個(gè)對(duì)棉鈴蟲的抗性達(dá)到了100%；Yuan Ma等[20]研究了蟲害誘導(dǎo)楊樹胰蛋白酶KTI基因過量表達(dá)情況，明確了楊樹KTI基因家族的功能多樣性及其抗病抗蟲作用。徐平麗等[21]從小麥中克隆到一個(gè)BBI型蛋白酶抑制劑TaUES基因，并證明其參與了鹽和干旱脅迫應(yīng)答。目前在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有三大類蛋白酶抑制劑——絲氨酸蛋白酶抑制劑、琉基蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑，PPTI蛋白屬于第一類。絲氨酸蛋白酶抑制劑也已至少發(fā)現(xiàn)有6個(gè)家族，但只有部分成員具有較強(qiáng)抗性功能，除了以上幾個(gè)以外，還有弧豆、馬鈴薯的蛋白酶抑制劑等，但已發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑對(duì)抗逆境種類和作用效果千差萬(wàn)別?，F(xiàn)有毒性的蛋白酶抑制劑基因搭配組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物，其蛋白酶抑制劑表達(dá)量仍然較低，一般達(dá)不到蚜蟲的致死劑量。

綜上所述，從國(guó)內(nèi)外抗蚜基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀來(lái)看，存在以下4個(gè)問題：（1）植物對(duì)蚜蟲的抗性機(jī)制很復(fù)雜，可用的單顯抗生性基因很少；（2） 蚜蟲種類很多，現(xiàn)有基因抗蚜種類過于單一；（3） 廣譜的植物凝集素因大多含有糖鏈，而用基因工程的方法很難表達(dá)正確的糖鏈；（4）現(xiàn)有毒性的蛋白酶抑制劑基因搭配組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物，一般達(dá)不到致死劑量。目前，真正有效的無(wú)公害防治蚜蟲機(jī)制還未建成。

2 植物抗蚜的發(fā)展趨勢(shì)

植物在遭受到昆蟲取食時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，合成對(duì)攻擊者有毒的防御物質(zhì)，這是生物害蟲無(wú)公害防治的基本原理[22，23]，也是抗蚜研究的主要趨勢(shì)。掌葉半夏本身沒有特殊氣味，卻一直都保持很強(qiáng)的對(duì)各類蚜蟲的抗性，是掌葉半夏PPTI具有更強(qiáng)的抗性，還是有更多的物質(zhì)參與其中？目前，蛋白酶抑制劑基因抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)[22，24]，但大多數(shù)研究者認(rèn)為抑制機(jī)制主要表現(xiàn)在2個(gè)方面。一方面，蛋白酶抑制劑被攝入昆蟲體內(nèi)后與昆蟲腸道內(nèi)蛋白酶的活性部位或變構(gòu)部位結(jié)合，使昆蟲腸道內(nèi)蛋白酶失去原有活性，昆蟲不能得到足夠的營(yíng)養(yǎng)。趙飛等[25]研究了9種絲氨酸蛋白酶抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，從活性區(qū)拉式角（二面角）取向與對(duì)應(yīng)物二面角取向的角度演示了二者相互作用的機(jī)制，提出為抑制劑分類的“標(biāo)準(zhǔn)機(jī)制”。但對(duì)于造成不同植物胰蛋白酶抑制劑間抗蟲性能差異的原因，我們知之不多。另一方面，蛋白酶抑制劑刺激昆蟲過量分泌消化酶，通過神經(jīng)反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)，昆蟲不能攝取足夠的營(yíng)養(yǎng)。對(duì)此方面研究能夠支撐的實(shí)證更少，很有必要進(jìn)一步研究明確或補(bǔ)充其機(jī)理，用于提高蛋白酶抑制劑的抗蚜效果、指導(dǎo)觀賞植物的治蚜實(shí)踐。因此，研究掌葉半夏PPTI在觀賞植物上的抗蚜功能、完善其抗蚜機(jī)制成為該趨勢(shì)的關(guān)鍵所在。

3 PPTI的應(yīng)用分析

3.1 觀賞植物選擇

月季（Rosa Chinenses） 是觀賞植物的代表，為全球重要的觀賞植物之一，被廣泛應(yīng)用于城鄉(xiāng)綠化。在我國(guó)包括北京、天津和石家莊等在內(nèi)的近50個(gè)城市將月季定為“市花”，而月季在生長(zhǎng)季節(jié)中遭受蚜蟲為害很嚴(yán)重，雖然月季的組織培養(yǎng)和再生系統(tǒng)較為成熟[26]，但是其抗蚜蟲基因轉(zhuǎn)化尚未見報(bào)道?？梢钥闯?，PPTI率先在月季上應(yīng)用的條件已經(jīng)具備。從克隆掌葉半夏高性能基因開始，探究其抗蚜機(jī)理，進(jìn)行體內(nèi)、外抗蚜蟲功能分析和轉(zhuǎn)化應(yīng)用途徑研究，就可以用基因改造的方法解決蚜蟲在觀賞植物上較難防治的問題。

3.2 重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容

開展PPTI相關(guān)的功能及其抗性機(jī)制研究，利用PPTI蛋白進(jìn)行酵母表達(dá)和抗蟲范圍測(cè)定，將PPTI與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 進(jìn)行融合表達(dá)，進(jìn)行蚜蟲腸道內(nèi)定位和功能分析，同時(shí)采用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與PPTI互作的所有蚜蟲蛋白，通過分析互作蛋白與PPTI結(jié)合后引起的反應(yīng)，進(jìn)一步完善抗蚜蟲機(jī)制；通過轉(zhuǎn)化月季獲得高抗蚜蟲的新種質(zhì)，并利用基因改造、同源基因沉默等方法探究提升轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)PPTI含量的方法。本研究的意義一方面可用于指導(dǎo)觀賞園藝植物創(chuàng)制抗蚜新種質(zhì)、新品種，另一方面也為高效、低毒、抗蚜生物殺蚜劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，PPTI后續(xù)研究進(jìn)展對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境改善具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。