紙層析法分離葉綠體色素方法的低毒優(yōu)化

呂亞慈

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

葉綠體色素是植物吸收太陽光進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要由葉綠素a、葉綠b、胡蘿卜素和葉黃素組成。分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等，紙層析是其中較簡單的一種，也是學(xué)生試驗(yàn)中提取分離葉綠素的常用方法。但此方法使用較多的有毒試劑，如丙酮、CCl4等，存在層析時(shí)間長、分離效果較差等不足之處。所以，本文針對上述缺點(diǎn)對試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

1 試驗(yàn)方法

影響葉綠體色素層析試驗(yàn)效果主要有三個(gè)因素：對材料的處理、提取溶劑的選擇、層析劑的選擇。可以通過逐一改變其影響因素(其他的和對照組相同)的方法分別測出在這三個(gè)因素方面的最優(yōu)良做法，從而獲得一個(gè)優(yōu)化后的分離方法。

1.1 材料的處理。稱取新鮮、去大葉脈的菠菜葉，按2 g/組稱取3組，分別對這3組材料做以下處理：①直接研磨，不做任何處理(傳統(tǒng)做法，為對照組)。②投入沸水中(30～40 s)后，立即放入冷水中(數(shù)秒)，撈出后用吸水紙吸干水分[1]。③在烘箱內(nèi)(48℃)烘干約半小時(shí)[2]，待材料處理好以后分別剪碎放入3個(gè)研缽中，加入少量的CaCO3(中和細(xì)胞中的酸，防止Mg2+從葉綠素中釋放)和石英砂進(jìn)行研磨，成勻漿后再加入10 ml丙酮，然后用漏斗過濾，得到3瓶葉綠體色素提取液，并標(biāo)號。后續(xù)采用相同的方法：圓形濾紙點(diǎn)樣，長7 cm、寬2 cm的濾紙條卷成紙捻，讓紙捻浸泡在CCl4+無水Na2SO4的層析液中進(jìn)行層析，觀察試驗(yàn)結(jié)果[3]。

1.2 提取液的選擇。合適的提取液能有效地提高色素的提取量，保證分離時(shí)會(huì)有好的效果。取去大葉脈的菠菜葉，按2 g/組稱取4組，剪碎并放入研缽中，加入少量的CaCO3和石英砂進(jìn)行研磨，待成勻漿后，分別加入丙酮(傳統(tǒng)做法，為對照組)、乙醇、丙酮+石油醚(2滴)、乙醇+石油醚(2滴)，4種提取液均為10 ml，過濾，得到4種葉綠體色素液，并標(biāo)號。經(jīng)過點(diǎn)樣、層析等相同步驟后，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 層析液的選擇。合適的層析劑使色素帶的分布更清晰，也能節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。本試驗(yàn)設(shè)置了不同的層析液：①CCl4加少量無水Na2SO4，作為對照組。②石油醚和CCl4，其比例為2∶1。③石油醚和苯，其比例為3∶1。④石油醚與苯，其比例為2∶1。用傳統(tǒng)的方法處理4組材料，研磨成勻漿后，加入10 ml的丙酮，過濾，得到葉綠體色素液。點(diǎn)樣用上述4種不同層析液進(jìn)行層析，標(biāo)號并記時(shí)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 選擇最優(yōu)的材料處理。利用分光光度計(jì)對3種色素提取液進(jìn)行測量，根據(jù)Lambert-Beer定律計(jì)算葉綠素含量，其結(jié)果如下：處理1：A663=1.023；A645=0.361Ct=15.500 mg/L；處理2：A663=1.013；A645=0.363Ct=15.461 mg/L；處理3：A663=0.925；A645=0.328Ct=14.047 mg/L

從以上數(shù)據(jù)可以看出：兩組值中，處理1與處理2均較為接近，處理3最?。辉俳Y(jié)合層析得到的結(jié)果，可以判斷出處理1與處理2對葉綠素的提取量較大，而處理2更有利于黃色素的提取。所以，本試驗(yàn)選擇處理2的方法。

2.2 選擇最優(yōu)的提取液。通過觀察層析結(jié)果得出：①丙酮：分離效果較好但是時(shí)間較長，丙酮有劇毒。②乙醇：價(jià)格低但是效果差。③丙酮+石油醚：提取較多的色素，分離效果較好，層析時(shí)間短，但是丙酮有劇毒。④乙醇+石油醚：提取較多的色素，分離效果好，層析時(shí)間短，成本較低。試驗(yàn)結(jié)論：在加了石油醚的提取液中，能提取出較多的色素，其中以黃色素最為明顯。雖然丙酮作為提取液的分離效果較好，但由于丙酮有毒，而乙醇替代丙酮后試驗(yàn)效果也很不錯(cuò)，最終本試驗(yàn)選擇了乙醇+石油醚作為最佳的提取液。

2.3 選擇最適的層析液。試驗(yàn)結(jié)果：①CCl4+無水NaSO4(對照)：層析效果一般且用時(shí)最長。②石油醚+CCl4：層析效果一般且用時(shí)較長。③石油醚+苯：效果較好，用時(shí)較短。④石油醚+苯：效果較好，用時(shí)最短。因此，在用石油醚和苯以2∶1比例混合作層析劑時(shí)，層析的時(shí)間最短、層析的效果也是最好的。

3 最優(yōu)的試驗(yàn)方案

通過本試驗(yàn)，最終確定了一套從材料處理、提取液與層析劑的改進(jìn)等方面較傳統(tǒng)方法更優(yōu)化的分離葉綠體色素的方法，具體步驟如下：①稱取2 g去大葉脈的新鮮菠菜葉，將其投入沸水中30～40 s，撈出后立即放入冷水中，數(shù)秒后撈出，用吸水紙吸干水分。②將處理好的材料剪碎放入研缽中進(jìn)行研磨，待研磨成勻漿后加入乙醇與2滴石油醚，共10 ml，過濾，得到葉綠體色素提取液。③點(diǎn)樣：用毛細(xì)吸管吸取提取液，在濾紙條的靠上方點(diǎn)上密集的點(diǎn)或劃細(xì)線，然后用電吹風(fēng)吹干(或自然晾干)，重復(fù)點(diǎn)樣6～7次。④做紙捻：再將紙條卷成紙筒，用剪刀將下端沒有點(diǎn)樣的部分剪成小刷子狀，做成紙捻。⑤層析：將做好的紙捻分別插入到已在圓心處開好孔的圓形濾紙上，以石油醚和苯2∶1比例的混合液作為層析劑，進(jìn)行層析，19～23min后層析結(jié)束，得到清晰的色帶。