補(bǔ)腎化瘀方對多囊卵巢大鼠子宮內(nèi)膜降鈣素表達(dá)的影響※

● 侯麗瑩 鄧麗玲 羅 佩 楊正望 熊 芬 胡齊欣 余曦明▲

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種極為復(fù)雜的疾病，涉及內(nèi)分泌、生殖、代謝疾病等多個方面，隨著其發(fā)病率的日益增加，越來越受到人們的重視。由于其稀發(fā)排卵或者無排卵、卵子質(zhì)量差等多種因素導(dǎo)致不孕，困擾了大多數(shù)有生育期望的PCOS患者。既往對于PCOS患者不孕問題的研究主要重點(diǎn)在于如何促進(jìn)排卵、降低雄激素水平，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究PCO大鼠也多集中在觀察卵巢、外周血的變化。雖然取得了一定的療效，但早期研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過藥物治療、糾正不排卵的因素后，排卵率確實(shí)得到提升可達(dá)至80%，但最終妊娠率維持在40%～50%之間，失敗率可高達(dá)50%[1]。隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為除了卵巢排卵方面的異常導(dǎo)致PCOS患者不孕，子宮內(nèi)膜容受性降低也是其不孕和妊娠成功率較低的重要原因。子宮內(nèi)膜發(fā)育及胚胎容受性障礙，是影響PCOS患者生育力低下，且妊娠結(jié)局不良的因素之一。因此，如何提高子宮內(nèi)膜容受性成為婦產(chǎn)科相關(guān)的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。

PCOS的中醫(yī)藥治療以補(bǔ)腎化瘀為主要目標(biāo)進(jìn)行攻關(guān)，既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎化瘀方對PCOS患者卵巢局部微環(huán)境有改善作用[2]。隨著認(rèn)識的深入，我們前期臨床研究表明補(bǔ)腎化瘀方可提高著床期子宮內(nèi)膜的容受性[3]，而且研究表明CT參與子宮內(nèi)膜容受性形成，且以多種機(jī)制參與胚胎著床[4]。為進(jìn)一步探討動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)腎化瘀方對子宮內(nèi)膜CT表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究其可能改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1動物選用21 d 健康雌性SD大鼠，SPF級，共100只，體量為(75±15)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號為SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，許可證號為SYXK(湘)2013-0005。室溫20～26℃，相對濕度為40%～60%，保持通風(fēng)干燥，維持晝夜節(jié)律，每天光照10小時，架式分籠，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2藥物、試劑與儀器補(bǔ)腎化瘀方：紫石英15g，補(bǔ)骨脂8g，菟絲子8g，桑寄生8g，茺蔚子5g，澤蘭8g，澤瀉8g，土鱉蟲8g，三七3g，覆盆子8g，蓮子心3g，甘草3g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。取生藥85 g，浸泡于水中30 min，加熱沸騰后小火微沸30 min，分取藥液，濾渣再次加水煎30 min，兩次藥液合并，紗布過濾，置入水浴鍋中，濃縮后藥液濃度為生藥含量0.9 g/ mL，分裝無菌小瓶，4℃冰箱保存。

炔雌醇環(huán)丙孕酮片(商品名：達(dá)英-35)拜耳醫(yī)藥保健公司廣州分公司提供，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J201401114，21片/盒，生產(chǎn)批號：20100003。 DHEA粉末：純度99.16%，購自湖北芳通藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號為：20120518。注射用大豆油：購自蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司，生產(chǎn)批號：Y12080204-3-07。

托盤式天平(上海精密儀器儀表有限公司YPN60)、低溫高速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司TD6-WS)，恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國LEIKA儀器有限公司RM2235)、脫水機(jī)及包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)、生物組織攤片機(jī)(浙江金華市金迪醫(yī)療設(shè)備廠金迪YD-A)、海爾電冰箱(青島海爾股份有限公司BCD-226SKA)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造商有限公司一恒DNP-9162)、掃描電子顯微鏡(日本日立公司)、離子濺射儀(日本日立公司)、凍干機(jī)(日本日立公司)、Motic BA410研究型顯微鏡(廈門麥克迪奧集團(tuán)公司)、Motic Images Plus6.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克迪奧集團(tuán)公司)。

2 方法

2.1 PCO大鼠模型的制備與評價參照張曉薇、李燕等[5-6]造模方法，由于每天每只大鼠均需稱量不等的DHEA單獨(dú)配制不同濃度的注射液，在此基礎(chǔ)上對DHEA注射液的配制進(jìn)行調(diào)整，按DHEA6mg/(100g體重·d)+0.2mL注射油劑(大豆油)來換算，100g體重大鼠應(yīng)配制注射液濃度為6mg/0.2mL，即30mg/mL，將此作為DHEA注射液的標(biāo)準(zhǔn)濃度，注射量按0.2mL/100g體重來計算，保持注射液濃度恒定，配制DHEA溶液酒精燈加熱溶解均勻后，按不同大鼠重量抽吸不同體積的注射液。空白對照組30只，予頸背部皮下注射2mL/kg注射用大豆油劑，并輕輕揉按促進(jìn)吸收。模型制備組70只予DHEA 0.06g/(kg·d)+0.2mL注射用大豆油劑，配制溶液方法如前所述，頸背部皮下注射，并輕輕揉按促進(jìn)吸收，兩組給藥于每日上午十點(diǎn)同期進(jìn)行。經(jīng)測量，從23～43d，SD雌性大鼠體重約為60～210g，注射量在0.12～0.42mL之間浮動。定期觀察攝食、毛發(fā)及精神、一般活動情況，注射10d后開始每天下午4時進(jìn)行1次陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，用光滑吸管吸取少量生理鹽水，沖入大鼠陰道內(nèi)，吸取少量陰道液，涂于載玻片上直接光鏡觀察，觀察其動情周期變化。依照文獻(xiàn)中陰道脫落細(xì)胞學(xué)特征，確定動情周期，大鼠動情周期可分為前期、間期、動情期、后期，主要取決于白細(xì)胞和核上皮細(xì)胞的多少以及有無角化細(xì)胞的形成來判別，間期白細(xì)胞(大量)>后期(約1/3)>動情期(無)，而前期主要為核上皮細(xì)胞，動情期角化細(xì)胞數(shù)目增多[7]。注射10d后每天下午4時進(jìn)行1次陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，模型制備組鏡下可見大量白細(xì)胞，動情間期時間變長，打破了周期的規(guī)律性，提示構(gòu)建模型后，由于病理的改變影響到PCO大鼠，從而出現(xiàn)卵巢功能的異常，進(jìn)一步表現(xiàn)為間期為主的變化；空白對照組可出現(xiàn)正常的周期次序。注射第20d當(dāng)晚20時禁食，第21d晨起各組隨機(jī)抽取10只大鼠，稱重后頸椎脫臼法處死，頸動脈采血，抗凝采血管采集，離心后用移液器取上清液，用放免法檢測血清激素LH、FSH、T、P、E2，按放免試劑盒說明操作，采血后解剖雙側(cè)卵巢，以卵巢最大平面作為待檢平面石蠟包埋，HE染色后顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化，判定造模是否成功。

2.2給藥干預(yù)方法判定造模成功后，模型制備組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組，分別是模型對照組、補(bǔ)腎化瘀方組、達(dá)英-35組各20只，加上空白對照組20只，共80只。補(bǔ)腎化瘀方組每日按時予補(bǔ)腎化瘀湯劑灌胃，1次/ d，給藥劑量[8-9]按成人女性平均體重60kg體表面積換算，折合到大鼠用藥劑量8.8 g/(kg·d)，結(jié)合“1.2”所述中藥湯劑濃度即10mL/(kg·d)；達(dá)英-35組每天灌服達(dá)英-35溶液，人用藥量為1片/d，折合大鼠約為0.101片/(kg·d)，即0.00023g/(kg·d)，將1片達(dá)英-35溶于100mL蒸餾水中，約為10mL/(kg·d)；空白對照組以與模型對照組同等量的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃21d，停藥7d為1個周期，共給藥3個周期。停藥5天后按雌雄鼠1∶1的比例交配，次日清晨檢查大鼠陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓日記為妊娠第1日。

2.3標(biāo)本采集與指標(biāo)測定妊娠第四天清晨以頸椎脫臼法處死大鼠，剖取大鼠子宮及雙側(cè)卵巢，將其表面脂肪去除干凈后，均以4%多聚甲醛固定，卵巢HE染色后在顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。子宮內(nèi)膜行免疫組化法檢測CT表達(dá)。按照試劑盒說明書進(jìn)行，工作濃度為1：100，以細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或者棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性表達(dá)。切片置于400倍高倍鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇觀察5個高倍鏡視野，對每張照片進(jìn)行分析，采用Motic Images Plus 6.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析，以切片背景的灰度值作背底校正，測定平均光密度值(average optical density，AOD)。

3 結(jié)果

3.1大鼠卵巢形態(tài)組織學(xué)空白對照組大鼠肉眼觀見卵巢色澤較紅潤，HE染色光鏡下可見多個處于不同生長層次的卵泡，且細(xì)胞排列整齊，多層次的變化，可多達(dá)8～9層。模型制備組大鼠肉眼觀見卵巢表面蒼白，包膜增厚，隱約可見擴(kuò)張的囊泡，光鏡下可見囊狀卵泡，水泡樣改變，空腔增大，卵泡內(nèi)可見卵母細(xì)胞及放射冠消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列較為疏松，提示PCO大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)病理改變與患者PCOS臨床表現(xiàn)一致，結(jié)合“2.1”動情周期變化結(jié)果以動情間期為主，失去規(guī)律性，提示PCO大鼠模型造模成功。見圖1。

A.空白對照組 B.模型制備組

3.2大鼠血清性激素水平比較造模后對兩組血清性激素水平進(jìn)行統(tǒng)計分析，單因素方差分析出的結(jié)果表明：空白對照組大鼠血清T水平明顯低于模型制備組(P<0.01)，E2水平高于模型制備組(P<0.01)，兩組在FSH、LH、P水平上結(jié)果提示無顯著差異(P>0.05)。提示造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較

注：與空白對照組比較，△P<0.01。

3.3各組大鼠子宮內(nèi)膜CT表達(dá)的結(jié)果與空白對照組比較，補(bǔ)腎化瘀組、模型對照組、達(dá)英-35組CT表達(dá)強(qiáng)度降低(P<0.01)；與模型對照組比較，補(bǔ)腎化瘀組、達(dá)英-35組CT表達(dá)強(qiáng)度增高(P<0.01)。見表2。

組 別nCT平均光密度值空白對照組200．557±0．695模型對照組200．278±0．120△補(bǔ)腎化瘀組200．390±0．059△★達(dá)英-35組200．332±0．058△★

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.01。

A.空白對照組；B.模型對照組；.C.補(bǔ)腎化瘀方組；D.達(dá)英-35組

圖2各組大鼠子宮內(nèi)膜種植窗期CT的表達(dá)(免疫組織化學(xué)法×400)

4 討論

PCOS的模型建立有多種，既往實(shí)驗(yàn)研究報道[5-6]，運(yùn)用DHEA造模方法成功誘導(dǎo)在內(nèi)分泌及卵巢形態(tài)學(xué)方面與人類PCOS患者相似的大鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)模型大鼠同時伴有空腹血糖增高及高胰島素血癥，認(rèn)為此種動物模型下丘腦-垂體-卵巢軸保持完整，是一種研究PCOS內(nèi)分泌及卵巢病理改變的理想模型。因此本實(shí)驗(yàn)采用較為經(jīng)典的DHEA誘導(dǎo)PCO模型的建立。

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示DHEA誘導(dǎo)PCO大鼠模型可行。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以DHEA構(gòu)建的PCO大鼠模型作為研究對象，觀察大鼠動情周期、卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變以及PCO大鼠血清性激素水平的變化，結(jié)果顯示：造模后，模型制備組肉眼觀顏色較為蒼白，鏡下存在多個呈囊樣擴(kuò)張的形態(tài)不規(guī)則的空卵泡，卵巢顆粒細(xì)胞排列紊亂且呈多囊樣改變，動情周期失去規(guī)律變化，血清T水平明顯較高，血清E2水平明顯較低，符合人類PCOS血清性激素變化。因此本模型無論是從卵巢形態(tài)學(xué)變化還是從內(nèi)分泌改變進(jìn)行評價，都是一種較為理想的PCOS動物模型。DHEA誘導(dǎo)的PCO大鼠模型更符合我們的實(shí)驗(yàn)要求。

精子與卵子的結(jié)合促使了胚胎的發(fā)生，在人類胚胎著床成功是一個復(fù)雜的程序化過程，任何一個環(huán)節(jié)異常都可能導(dǎo)致胚胎丟失或者著床失敗[10]。胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛能、子宮內(nèi)膜容受性及子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境等都可影響生殖過程。其中子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜的一種狀態(tài)或者可以稱之為接受能力，子宮內(nèi)膜容許胚胎定位、黏附并植入其中，達(dá)到能夠準(zhǔn)備接受胚胎植入的狀態(tài)。其受到嚴(yán)格的時空限制，這個短暫特定的敏感時期，常稱作“種植窗口期”，大約在排卵后的6～9d，或者月經(jīng)周期的第20～24d[11]。這個關(guān)鍵時期，若內(nèi)膜與胚泡發(fā)育同步才能達(dá)到子宮內(nèi)膜容受性較為良好的狀態(tài)，才能夠順利著床，否則就會著床障礙。因此，如何提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜與受精卵的發(fā)育同步性，成為婦產(chǎn)科領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。隨著PCOS發(fā)病率日益上升，其生殖問題也是研究焦點(diǎn)中重點(diǎn)關(guān)注方面之一。PCOS患者的突出問題是生殖障礙，與其他癥候群相互影響，內(nèi)分泌紊亂、胚胎發(fā)育潛能受損、子宮內(nèi)膜容受性的降低都可能導(dǎo)致其生殖障礙[12]。促排卵是一直以來的重點(diǎn)之一，而如何改善PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性是近年的熱點(diǎn)方向，中西醫(yī)都為此進(jìn)行不斷地探索。

早在1994年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CT在子宮內(nèi)膜“種植窗”的形成中起著重要作用[13]。隨著研究方法和技術(shù)手段的更新，降鈣素多機(jī)制調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎的植入與發(fā)育，為不孕不育的治療提供新的靶點(diǎn)。降鈣素是一種肽類激素，主要是通過甲狀腺濾泡旁細(xì)胞合成和分泌。研究發(fā)現(xiàn)子宮能夠合成極少量的降鈣素，雖然低于甲狀腺合成的CT，但是子宮通過自分泌、旁分泌兩種途徑控制鈣離子的平衡從而調(diào)節(jié)植入時子宮容受狀態(tài)[14]。降鈣素能夠特異性表達(dá)于種植窗期子宮內(nèi)膜，被認(rèn)為是在這段敏感的短暫時期最有價值的生化標(biāo)志物[15]，本研究顯示CT主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中，與空白對照組比較，模型制備組CT表達(dá)下降，提示子宮內(nèi)膜容受性下降可能與CT表達(dá)異常有關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為“腎為先天之本”，主生殖，腎精充盛可促進(jìn)精卵的發(fā)育、內(nèi)膜的長養(yǎng)。若腎氣不足，或后天失于養(yǎng)護(hù)，精血匱乏，血海無以盈溢，則天癸泌至及沖任通盛受到影響，導(dǎo)致月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕等。若腎陰不足，癸水不充則精卵、內(nèi)膜失滋致精卵不能發(fā)育或發(fā)育不全；若腎陽不足，氣化無力則精卵發(fā)育長養(yǎng)動力不足。腎虛引發(fā)腎陰腎陽的失調(diào)，從而導(dǎo)致腎陰失滋，腎陽失化致無排卵、排卵障礙。PCOS的病因病機(jī)復(fù)雜，變化多端，以腎虛為本，可兼見脾虛、肝郁、痰濕、血瘀等，故補(bǔ)腎乃為治法之根本。PCOS由于腎虛涉肝及脾而生痰濁、瘀血，同源互衍，相互影響。元代朱丹溪首次提出：“痰挾瘀血，遂成窠囊?！庇纱丝梢钥闯觥梆觥钡牟±碜兓cPCOS病理結(jié)局類似。本研究采用導(dǎo)師多年來治療PCOS的基礎(chǔ)方補(bǔ)腎化瘀方，從補(bǔ)腎化瘀的角度出發(fā)，取得了一定的療效。方中由紫石英、補(bǔ)骨脂、菟絲子、桑寄生、茺蔚子、澤蘭、澤瀉、土鱉蟲、三七、覆盆子、蓮子心、甘草組成。其中紫石英，取甘溫之性溫補(bǔ)肝腎，暖宮助孕，正如《神農(nóng)版本草經(jīng)》謂其可“補(bǔ)不足，女子風(fēng)寒在子宮，絕孕十年無子”；補(bǔ)骨脂以滋補(bǔ)腎陽為主，具有雌激素樣作用，《本草疏經(jīng)》謂其：“暖水臟，陰中生陽，壯火益土之要藥也?！倍吆嫌?，養(yǎng)腎陰，化腎陽，陰陽互根，腎精充足，共為君藥。菟絲子能夠補(bǔ)腎精，性偏平和，陰陽雙補(bǔ)，陰中有陽，守而能走；桑寄生滋補(bǔ)精血，覆盆子具補(bǔ)益腎中元陽之能，滋養(yǎng)陰精之效，二者均歸肝腎二經(jīng)；蓮子能夠交通心腎，清心安神，可防溫燥之弊，茺蔚子具活血化瘀調(diào)經(jīng)功效。上均為臣藥。澤蘭、澤瀉破瘀血，活血利水；三七止血化瘀，祛瘀補(bǔ)正；土鱉蟲加強(qiáng)破血逐瘀之功；茺蔚子具活血化瘀調(diào)經(jīng)功效。上均為佐藥。甘草調(diào)和諸藥為使藥。全方補(bǔ)腎活血，化瘀調(diào)經(jīng)，對改善子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境有促進(jìn)作用?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血化瘀可能增加內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)[16]。本研究中，與模型對照組比較，補(bǔ)腎化瘀方組子宮內(nèi)膜的CT 表達(dá)上調(diào)，因此我們認(rèn)為補(bǔ)腎化瘀方可上調(diào)子宮內(nèi)膜上CT表達(dá)，可能是補(bǔ)腎化瘀方改善子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制之一。

綜上所述，補(bǔ)腎化瘀方可在改善子宮內(nèi)膜容受性方面產(chǎn)生積極作用，提示作用機(jī)制可能與上調(diào)子宮內(nèi)膜CT表達(dá)有關(guān)。但影響子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)生物活性因子及其他因素十分復(fù)雜，目前有部分研究較為深入的指標(biāo)只能作為輔助，且中藥作用于子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制尚不完全清楚，亟待進(jìn)一步拓展更為深入的研究，為中醫(yī)藥在治療PCOS方面提供合理的科學(xué)依據(jù)。

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