hTERT 基因反義核酸對TNF-α抗SCID小鼠氟它胺耐受型前列腺癌影響機制研究*

高曉東 陳一戎 李永新 苗海東 張祖萍

1. 甘肅省中醫(yī)院 血液凈化中心（甘肅 蘭州 730050）；2. 甘肅省人民醫(yī)院泌尿外科

前列腺癌是男性泌尿系最常發(fā)生的腫瘤,在美國其發(fā)病率在腫瘤患者中占第一位,死亡率占第二位[1]。研究表明[2]，前列腺癌細(xì)胞屬于雄激素依賴性細(xì)胞，通過抑制人體雄激素的產(chǎn)生，前列腺癌細(xì)胞生長速度變緩，出現(xiàn)惰性生長的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)前列腺癌轉(zhuǎn)移灶萎縮的情況，治療效果良好。隨著抗雄藥物的治療，前列腺癌細(xì)胞會由雄激素依賴性轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴型，抗雄藥物治療會逐漸失去作用[3]。對于雄激素非依賴型前列腺癌的治療，目前臨床上沒有一個行之有效的方法，是臨床上最棘手的問題之一[4]。我們前期通過體外細(xì)胞實驗證實端粒酶hTERTAS PSODN對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的氟它胺耐受型前列腺癌LNCaP-flu細(xì)胞凋亡有增敏作用。本實驗建立氟它胺耐受型前列腺癌模型，探討hTERT基因AS PS-ODN對TNF-α抗腫瘤的影響機制，為雄激素非依賴型前列腺癌的亞臨床研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

材料和方法

一、材料

（一）主要試劑

PMBI-1640培養(yǎng)粉為北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品，胎小牛血清為蘭州民海生物制品公司產(chǎn)品，TNF-α為武漢博士德生物制品公司產(chǎn)品。SCID小鼠購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

（二）引物合成

從基因庫中查出hTERT基因mRNA的全部，根據(jù)hTERT基因mRNA的序列分析，設(shè)計出互補于起始密碼子的反義片段，選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基共20個堿基長度為作用的靶序列。hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸的序列為5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，; 正義核酸序列為5，-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3，，每一條鏈進(jìn)行全硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合成，純化，分裝。各序列經(jīng)計算機網(wǎng)上檢索證實與hTERT基因以外的已知人類基因無同源性。hTERT上游引物5，-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3，；下游引物為5，-GGATGAAGCGCAGTCTGGA-3，,均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

二、方法

（一）氟它胺耐受型前列腺癌細(xì)胞系LNCaP-flu的培養(yǎng)

LNCaP細(xì)胞株由蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供。將LNCaP細(xì)胞置入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中。羥基氟它胺用無水乙醇溶解后加入磷酸鹽緩沖液（PBS，常規(guī)培養(yǎng)于pH7.2）至羥基氟它胺終濃度為10-4mol/L儲存。LNCaP細(xì)胞加入羥基氟它胺至終濃度為10-7mol/L后連續(xù)培養(yǎng)18個月，使之成為氟它胺耐受型前列腺癌細(xì)胞LNCaP-flu，遴選增值活躍的細(xì)胞作為接種細(xì)胞。

（二）氟它胺耐受型前列腺癌動物模型的建立

將LNCaP-flu細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，離心后去上清，用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至取0.1mL總數(shù)為5×106個細(xì)胞，并混合Matrigel膠，分別接種于SCID小鼠頸部皮下各20只，成瘤后計算成瘤率。隨機將LNCaP細(xì)胞種植荷瘤小鼠分為2組；將LNCaP-flu細(xì)胞種植荷瘤SCID小鼠隨機分為2組；其中2組SCID小鼠給予氟它胺20mg/kg皮下注射，每周2次，另外2組作為對照，動態(tài)觀察腫瘤的生長情況。

（三）病理學(xué)觀察

將LNCaP、LNCaP-flu細(xì)胞種植瘤組織病理學(xué)觀察用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木紅-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡組織病理學(xué)觀察。

（四）蛋白表達(dá)鑒定

將LNCaP、LNCaP- fl u細(xì)胞種植瘤分別進(jìn)行AR，PSA蛋白表達(dá)鑒定

（五）藥物干預(yù)

按上述方法建立氟它胺耐受型前列腺癌SCID小鼠動物模型，自種植后第21天將LNCaP-flu細(xì)胞成瘤小鼠隨機各分成7組，每組6只。

首先進(jìn)行預(yù)實驗，將hTERTAS PS-ODN 不同作用劑量1mg/kg ?d-1、5mg/kg ?d-1及10mg/kg?d-1分別進(jìn)行瘤體內(nèi)局部注射，每天注射 1次，連續(xù)給藥 15d。采用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)細(xì)胞，描繪生長曲線，并收集細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性測定，得出最適AS PS-ODN作用劑量。

實驗分為TNF-α組、AS PS-ODN+TNF-α組及空白對照組。4μg/ml TNF-α每天每只0.2mL/10g灌胃給藥，連續(xù)15d；結(jié)合組按照hTERTAS PSODN5mg/kg?d-1劑量進(jìn)行瘤體內(nèi)局部注射，每天注射1次，連續(xù)給藥 15d；結(jié)合TNF-α 4μg/mL，每天每只0.2mL/10g灌胃給藥，連續(xù)15d；空白對照組按每天每只0.2mL/10g灌胃0.9%氯化鈉液，連續(xù)15d。

（六）干預(yù)指標(biāo)檢測

1. 腫瘤抑制率測定：按上述方法末次給藥24h，頸椎脫臼處死動物，分別稱體重，瘤重，計算腫瘤抑制率，進(jìn)行療效評價。抑制率=（未處理組瘤重-治療組瘤重）/未處理組瘤重×100%。

2. 腫瘤細(xì)胞生長周期時間測定：tc=[log(1+G)/log(m2/m1)]×t，G為腫瘤生長組分，m2，m1為組分中不同觀察時間的腫瘤質(zhì)量，t為觀察間隔時間。

3. 腫瘤組織病理學(xué)檢測：取出皮下腫塊，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)。

結(jié) 果

一、實驗動物荷瘤情況

實驗組和對照組各 20只SCID小鼠, LNCaP細(xì)胞接種成瘤率 75%（15/20），LNCaP-flu細(xì)胞接種成瘤率50%（10/ 20）。所有腫瘤均出現(xiàn)在接種部位，未觀察到腫瘤的遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移。各組瘤質(zhì)量和瘤體積比較，LNCaP組與 LNCaP-flu組瘤質(zhì)量、瘤體積比較差異明顯（P＜0.05）。

二、種植瘤切片的病理情況

腫瘤組織甲醛固定,石蠟包埋、切片、HE染色后，LNCaP-flu細(xì)胞接種成瘤組織切片，光鏡顯示：腫瘤組織與周圍正常組織界限明確，呈典型的瘤細(xì)胞表現(xiàn)，分化低，核大深染，形態(tài)不均一，核分裂象多見，但與臨床腫瘤細(xì)胞形態(tài)略有差異。

三、AR、PSA蛋白表達(dá)的鑒定

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測顯示所有腫瘤組織中，AR染色均為陽性，PSA染色均為陰性。

四、不同藥物對模型的腫瘤生長抑制作用

AS PS-ODN+TNF-α、TNF-α組及空白對照組模型動物灌胃給藥30d，結(jié)果顯示藥物對模型腫瘤具有明顯的生長抑制作用，AS PS-ODN+TNF-α抑制率達(dá)到35.8%，具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

五、腫瘤細(xì)胞生長周期時間、SCID小鼠生存時間的比較

各組荷瘤SCID小鼠腫瘤細(xì)胞生長周期時間和生存期,對照組腫瘤生長快，細(xì)胞生長周期時間為（1.7±0.2）d, 其中4只發(fā)生腹腔臟器廣泛轉(zhuǎn)移, 嚴(yán)重腹水, 平均生存期為（28±10.4）d。TNF-α組細(xì)胞生長周期時間為（1.8±0.3）d，平均生存期分別為（35±11.5）d。雖然腫瘤生長受到抑制, 荷瘤小鼠生活質(zhì)量較差, 全血細(xì)胞數(shù)明顯低于AS PSODN+TNF-α組（P＜0.01）。AS PS-ODN+TNF-α組細(xì)胞生長周期時平均為（90.6±13.2）d，平均生存期分別為（34±11.3） d。

六、腫瘤組織病理學(xué)檢測

AS PS-ODN+TNF-α組顯微鏡下觀察到許多凋亡細(xì)胞；對照組沒有觀察到凋亡細(xì)胞，見圖1。

表1 不同藥物對模型腫瘤生長抑制作用（s）

表1 不同藥物對模型腫瘤生長抑制作用（s）

與對照組、TNF-α 組比較*P＜0. 05

組別劑量(mg/kg)體質(zhì)量(g)瘤質(zhì)量(g)抑制率(g)0d30d對照組20.8±1.427.6±2.03.26±0.61 TNF-α421.4±1.324.8±1.72.53±1.30 27.7 AS PS-ODN+TNF-α5±421.2±0.724.3±1.60.75±0.28*35.8

圖1 腫瘤組織病理學(xué)檢測（HE×100）

討 論

本研究將原發(fā)的SCID小鼠氟它胺耐受型（雄激素非依賴型）前列腺癌細(xì)胞種植到小鼠背部皮下, 建立了種植性氟它胺耐受型前列腺癌動物模型。此模型基本模擬人前列腺癌發(fā)病過程，最能反映人前列腺癌發(fā)病機理及分子生物學(xué)變化。

我們運用前期培養(yǎng)的氟它胺耐受前列腺癌細(xì)胞LNCaP-flu[5]和 LNCaP細(xì)胞，結(jié)合應(yīng)用Matrigel膠接種SCID小鼠皮下，其中LNCaP細(xì)胞接種成瘤率75%（15/20），LNCaP-flu細(xì)胞接種成瘤率達(dá) 5 0%（10/20），各組瘤質(zhì)量和瘤體積比較發(fā)現(xiàn), LNCaP-flu組成瘤SICD小鼠注射氟它胺后與未注射氟它胺的LNCaP組、 LNCaP-flu組SICD小鼠相比較,它們組間的瘤質(zhì)量、瘤體積無明顯差異（P＞0.05），與注射氟它胺的 LNCaP組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LNCaP-flu細(xì)胞接種荷瘤小鼠對于氟它胺注射無明顯反應(yīng), 證實LNCaP-flu細(xì)胞接種的瘤組織對于氟它胺有耐受現(xiàn)象。氟它胺作用 LNCaP-flu細(xì)胞阻斷雄激素受體AR后，可以導(dǎo)致多細(xì)胞生長相關(guān)基因表達(dá)的改變[6]。雄激素受體免疫組化檢測為陰性，表明缺乏雄激素受體表達(dá),證明建立的種植腫瘤為雄激素非依賴型前列腺癌。此研究和Olvera等[7]的實驗結(jié)論一致，但未見腫瘤有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)，有關(guān)氟他胺耐受前列腺癌細(xì)胞系LNCaP-flu 種植瘤轉(zhuǎn)移情況，尚待進(jìn)一步研究。

本實驗建立氟它胺耐受型前列腺癌細(xì)胞LNCaP-flu動物模型[8]，明確不同藥物對動物模型腫瘤生長的抑制作用。結(jié)果顯示：AS PS-ODN+TNF-α對動物模型腫瘤具有明顯的生長抑制作用，荷瘤SCID小鼠腫瘤細(xì)胞生長周期時間和生存期延長，與TNF-α及對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明AS PSODN+TNF-α對SCID小鼠腫瘤細(xì)胞生長具有明顯抑制作用。此研究和體外細(xì)胞實驗結(jié)論一致[9]，與文獻(xiàn)報道的氟它胺耐受型前列腺癌動物模型研究結(jié)果一致[7]。

總之，端粒酶hTERT基因全硫代反義寡核苷酸對TNF-α誘導(dǎo)的SCID小鼠氟它胺耐受型（雄激素非依賴型）前列腺癌細(xì)胞LNCaP-flu凋亡有協(xié)同作用。此研究為雄激素非依賴型前列腺癌的亞臨床研究提供科學(xué)的理論依據(jù)，為雄激素非依賴型前列腺癌治療提供新的途徑。

1 Spain E,Gilgunn S,Sharma S,et al. Detection of prostate specific antigen based on electrocatalytic platinum nanoparticles conjugated to a recombinant scFv antibody.Biosens Bioelectron2016; 77: 759-766

2 Zhu S, Rousseau P, Lauzon C,et al. Inactive C-terminal telomerase reverse transcriptase insertion splicing variants are dominant-negative inhibitors of telomerase.Biochimie2014; 101(6): 93-103

3 Lee E, Madar A, David G,et al. Inhibition of androgen receptor and β-catenin activity in prostate cancer.Proc Natl Acad Sci USA2013; 110(39): 15710-15715

4 Boutin B, Tajeddine N, Vandersmissen P,et al. Androgen deprivation and androgen receptor competition by bicalutamide induce autophagy of hormone-resistant prostate cancer cells and confer resistance to apoptosis.Prostate2013; 73 (10): 1090-1102

5 Lin Z, Yang SP, Chen X. The hippo pathway effector YAP regulates motility, invasion, and castration-resistant growth of prostate cancer cells.Mol Cell Biol2015;35(8): 1350-1362

6 汪涌, 邵晨, 師長宏, 等. 雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞在其雄激素受體阻斷后細(xì)胞周期基因表達(dá)的改變. 中華實驗外科雜志 2004; 21(11): 1337-1338

7 Olvera-Caltzontzin P, Delgado G, Aceves C,et al. Iodine uptake and prostate cancer in the TRAMP mouse model.Mol Med2013; 19(8): 409-416

8 Adissu HA, McKerlie C, Di Grappa M,et al. Timp3 loss accelerates tumor in vasion and increases prostate inflammation in a mouse model of prostate cancer.Prostate2015; 75(16): 1831-1843

9 高曉東, 陳一戎. 端粒酶hTERT反義核酸對TRAIL誘導(dǎo)的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP細(xì)胞凋亡作用的研究.中國男科學(xué)雜志 2014; 28(5): 20-23