Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化方法的建立*

申雪沂 郭佳倩 牛長(zhǎng)敏 馬海濤 夏 靜 夏蒙蒙 王建軍 鄭 英

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（江蘇揚(yáng)州 225000）

細(xì)胞周期分為G1期（DNA復(fù)制前期）、S期（DNA復(fù)制期）和M期（DNA復(fù)制后期），細(xì)胞進(jìn)入或退出細(xì)胞周期的某一階段受多種因素調(diào)節(jié)，因而研究細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白功能需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處理。細(xì)胞周期同步化的方法包括物理方法或化學(xué)方法，其中化學(xué)方法，是指應(yīng)用化學(xué)藥物將細(xì)胞可逆的阻滯在特定時(shí)相[1,2]。不同細(xì)胞具有不同的細(xì)胞周期同步化方法，其中Hela細(xì)胞是經(jīng)典且最常用的生物研究用細(xì)胞株。由于Hela細(xì)胞具有能夠高效同步化到不同周期的優(yōu)勢(shì)，因此廣泛用于細(xì)胞周期的研究且方法較為成熟[3]。

維生素A在哺乳動(dòng)物多種生理過程中發(fā)揮重要作用，飲食中的維生素A一般儲(chǔ)存于肝臟，以視黃醇（retinol，ROL）的形式在血液中運(yùn)輸，其活性形式為視黃酸（retinoic acid，RA），RA對(duì)于正常的精子發(fā)生過程必不可少[4,5]。Stra8（stimulated by retinoic acid 8，Stra8）是RA的反應(yīng)基因之一，該基因在小鼠胚胎和出生后性腺中特異性表達(dá)[6,7]。據(jù)研究表明，Stra8蛋白可同時(shí)表達(dá)于生殖細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)，并根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)不同在核質(zhì)進(jìn)行穿梭，從而發(fā)揮不同的功能[8,9]。目前關(guān)于Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞的周期同步化方法還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中建立了Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞株， 在本研究中，主要參照Hela細(xì)胞探索Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化的方法 ，為后續(xù)Stra8在精原細(xì)胞中的作用機(jī)制研究提供實(shí)用性技術(shù)方法。

材料與方法

一、方法與材料

Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞株（以下簡(jiǎn)稱Stra8-GC1)為本實(shí)驗(yàn)室前期工作中建立。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胰酶，PBS均購(gòu)自WISENT試劑公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，青霉素/鏈霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞周期同步化試劑：胸苷（Thymidine），諾考達(dá)唑（Nocodazole），PI（Propidium iodide）均購(gòu)自美國(guó)SIGMA試劑公司，RNaseA購(gòu)自北京天根生化有限公司。Triton X-100購(gòu)自BIOSHARP試劑公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)方法

細(xì)胞傳代以后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3d，當(dāng)融合率達(dá)到85%以上時(shí)，再次傳代。

三、細(xì)胞周期同步化方法

（一）G1期細(xì)胞同步化方法

選取細(xì)胞融合率在20%～30%的Stra8-GC1， 用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h，收集細(xì)胞，70%酒精固定過夜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

（二）S期細(xì)胞同步化方法

選取細(xì)胞融合率在20%～30%的Stra8-GC1， 用含有 2.5mmol/L胸苷的培養(yǎng)液，在37°C，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14～16h，更換正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9h，再用含有2.5mmol/L胸苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)14～16h，再次更換正常培養(yǎng)液分別培養(yǎng) 0、3h、6h、9h，收集細(xì)胞，70%酒精固定過夜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

（三）M期細(xì)胞同步化方法

選取細(xì)胞融合率在80%～90%的Stra8-GC1， 用含有 100ng/ml諾考達(dá)唑的培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)4h、8h、12h，應(yīng)用物理震蕩（“shake off”）的方法收集細(xì)胞，70%酒精固定過夜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

（四）流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)

取固定過夜的細(xì)胞，4500rpm，離心3min，棄上清，用預(yù)冷PBS洗一次，棄上清。加入250 μL PI染液（含終濃度為50μg/mL的PI，20μg/mL 的RNaseA，1%Tritonx-100），混合后重懸細(xì)胞，避光4℃染色20min。使用流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每個(gè)樣品細(xì)胞數(shù)至少為1×104個(gè)，使用ModFit LTTM軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）常規(guī)顯微鏡觀察

1.3 樣本處理 每位研究對(duì)象均空腹采集EDTA抗凝血2 mL和促凝血3 mL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)使用EDTA抗凝血，促凝血1 610 g×10 min離心后分離血清，-70℃儲(chǔ)存待用。

Stra8-GC1細(xì)胞在剝奪血清后增殖均正常，在72h無(wú)血清培養(yǎng)后，細(xì)胞透明度增加，細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞變??；在加入胸苷培養(yǎng)后，細(xì)胞明顯變大變圓，換正常培養(yǎng)液后細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常；在加入諾考達(dá)唑之后，可觀察到細(xì)胞進(jìn)入分裂期，正在分裂的細(xì)胞貼壁不緊密，輕拍可掉落。

（二） 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

1. 無(wú)血清培養(yǎng)法同步化Stra8-GC1細(xì)胞至G1期：應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)阻斷細(xì)胞至G1期，分別收集阻斷24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中G1細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示無(wú)血清阻斷72h G1細(xì)胞數(shù)量最多，如圖1結(jié)果所示，圖1A為未同步化的正常細(xì)胞，G1期細(xì)胞比例為31.73%，圖1B為無(wú)血清阻斷法處理的細(xì)胞，G1期細(xì)胞比例在60%～70%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05）。

2. 胸苷阻滯法同步化Stra8-GC1細(xì)胞至S期：應(yīng)用胸苷阻滯細(xì)胞至S期，分別收集阻滯法處理后第二次培養(yǎng)0，3，6，9h的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中S期細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示胸苷阻滯法處理后,第二次釋放培養(yǎng)3h，收集的細(xì)胞中S期細(xì)胞數(shù)量最多，如圖2結(jié)果所示，圖2A為未同步化的正常細(xì)胞，S期細(xì)胞比例為38.50%，圖2B為胸苷阻滯處理的細(xì)胞，S期細(xì)胞比例在60%～70%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 無(wú)血清饑餓法同步化Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞至G1期

圖2 胸苷阻滯法同步化Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞至S期

3. 諾考達(dá)唑阻滯法同步化Stra8-GC1細(xì)胞至M期：應(yīng)用諾考達(dá)唑阻滯細(xì)胞至M期，收集阻滯法處理后培養(yǎng)4h、8h和12h的細(xì)胞，由于M期細(xì)胞具有貼壁疏松的特性，應(yīng)用物理震蕩（“shake off”）的方法收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中M期細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示諾考達(dá)唑阻滯法處理8h，收集的細(xì)胞中M期細(xì)胞數(shù)量最多，如圖3結(jié)果所示，圖3A為未同步化的正常細(xì)胞，M期細(xì)胞比例為13.85%，圖3B為諾考達(dá)唑阻滯處理的細(xì)胞，M期細(xì)胞比例在90%以上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05），達(dá)到較好的同步化效果。

圖3 諾考達(dá)唑阻滯法同步化Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞至M期

討 論

研究細(xì)胞周期依賴性調(diào)節(jié)要素，進(jìn)而闡明細(xì)胞增殖分裂的基本機(jī)制。將細(xì)胞群同步化至特定細(xì)胞周期具有多種細(xì)胞周期同步化方法，如血清剝奪、離心純化及藥物依賴性同步化等[10]。由于Hela細(xì)胞能夠應(yīng)用不同方法進(jìn)行細(xì)胞周期同步化[3]，因而參照Hela細(xì)胞，探索Stra8過表達(dá)精原細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化方法。

將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期S期的試劑有胸苷（2.5mM），羥基脲（HU：1mM）或阿非迪霉素 （1 μg/mL）。胸苷是最常見S期阻滯劑，它能減少核苷酸并抑制新DNA合成且毒性最小，在胸苷阻滯釋放之后更容易回到細(xì)胞周期[12]；HU能夠阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸，選擇性地抑制DNA的合成[13]；阿非迪霉素能夠選擇性的抑制NDA聚合酶α的合成，影響核DNA修復(fù)和線粒體DNA復(fù)制[14]。但是應(yīng)用HU或阿非迪霉素劑量較高或孵育時(shí)間較長(zhǎng)，都可能導(dǎo)致DNA破壞，甚至細(xì)胞死亡[12]。因此，胸苷是S期細(xì)胞周期同步化的首選試劑，包括一次胸苷阻滯法和二次胸苷阻滯法，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Hela細(xì)胞應(yīng)用二次胸苷阻滯法，首次釋放時(shí)間9h，足夠長(zhǎng)使其細(xì)胞跨過S期, 第二次釋放時(shí)間為24h內(nèi)每隔2h～3h收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞流式儀檢測(cè)，但是Hela細(xì)胞的S期細(xì)胞周期同步化的最佳第二次釋放時(shí)間還未見報(bào)道[3]。本研究在參照Hela基礎(chǔ)上，應(yīng)用二次胸苷阻滯法同步化Stra8-GC1至S期，第二次釋放時(shí)間分別為0、3h、6h和9h，并分別收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示二次釋放時(shí)間3h后細(xì)胞的S期同步化效率最好，達(dá)60%～70%。

將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期M期的的試劑包括秋水仙胺，諾考達(dá)唑等，其中諾考達(dá)唑通過阻滯微管裝配，在活性軸檢查點(diǎn)的中期終止有絲分裂，將細(xì)胞廣泛的阻滯在M期[2,12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Hela細(xì)胞應(yīng)用0.3μmol/L（90ng/mL）處理18h后，能夠獲得較高純度M期細(xì)胞[15]。因此，本研究細(xì)胞周期同步化方法參照Hela細(xì)胞，最終應(yīng)用100ng/mL諾考達(dá)唑分別處理Stra8-GC1細(xì)胞 4h、8h和12h，收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞流式儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)處理8h后細(xì)胞的M期同步化效率最好，達(dá)90%以上。綜合考慮諾考達(dá)唑具有一定細(xì)胞毒性，培養(yǎng)時(shí)間和藥物濃度均不再提高，并應(yīng)用物理震蕩方法收集細(xì)胞，從而提高細(xì)胞同步化效率，以及諾考達(dá)唑?yàn)榉撬苄裕虼宋覀儜?yīng)用DMSO配制諾考達(dá)唑，從而部分性降低諾考達(dá)唑細(xì)胞毒性作用[15]。

總之，在本研究中，通過參照Hela細(xì)胞同步化方法成功建立了Stra8過表達(dá)細(xì)胞株同步化方法，為之后Stra8在生精細(xì)胞不同細(xì)胞周期以及精子發(fā)生中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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