西洋梨品種‘紅考密斯’的組織培養(yǎng)及離體葉片不定梢再生

孫清榮　關秋竹　孫洪雁

摘要：以西洋梨（Pyrus communis L.）品種‘紅考密斯新生長的半木質化嫩枝莖段為外植體，促使腋芽萌發(fā)獲得無菌試管苗；以試管苗為試材，研究基本培養(yǎng)基、外源植物生長物質對增殖和生根的影響；以試管苗的離體葉片為外植體，研究植物生長物質的種類和濃度對葉片不定梢再生的影響。結果表明，試管苗適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；適宜的壯苗培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS（僅MS大量元素減半）+0.3 mg·L-1 NAA+20 g·L-1蔗糖，生根率為82.2%，平均單株根數為3.3條；葉片不定梢再生的最佳培養(yǎng)基為：NN69+2 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA，不定梢再生率為76.8%，平均每葉不定梢數為1.2個。

關鍵詞：西洋梨；紅考密斯；增殖；離體葉片；不定梢再生；生根

中圖分類號：S661.204+.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0028-05

Abstract Young semi-lignified branches were selected as explants， and axillary buds were promoted to germinate and to form in vitro shoots. In vitro shoots were selected as materials， the effects of basic medium and external plant growth substance on proliferation and rooting were examined. In vitro leaves were selected as explants， and the effects of the kinds and concentrations of plant growth substances on shoot regeneration were investigated.The results showed that the proper proliferation medium was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA and the proper medium for healthy shoots was MS+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA. The proper rooting medium was 1/2MS+0.3 mg·L-1 NAA+20 g·L-1 sucrose， the highest rooting rate was 82.2%， and the average root number per plantlet was 3.3. The optimal shoot regeneration medium was NN69+2 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA， the shoot regeneration frequency was 76.8%， and the average shoot number per leaf was 1.2.

Keywords Pyrus communis； Red Comice； Proliferation； In vitro leaf explants； Shoot regeneration； Rooting

梨果營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。過去人們習慣食用肉質細脆、香甜爽口的東方梨，但隨著生活水平的提高，人們對梨果的消費習慣日趨多樣化，肉質柔軟、香甜溶口、果心小的西洋梨也越來越受消費者喜歡?！t考密斯梨是由山東省果樹研究所從美國引進的一個優(yōu)良紅色西洋梨品種[1]。該品種是‘考密斯的一個濃紅型芽變，果皮全紅，果肉乳白色，后熟后汁液多，甜芳香味濃，是西洋梨中鮮食品質極佳的品種之一?！t考密斯梨在我國試栽表現，成熟果實具有鮮紅色漂亮外觀，而且具有石細胞少、汁液多、香味濃郁等果實品質，受到消費者青睞，市場售價較高，銷售形勢很好。但除與東方梨一樣易受各種病蟲害威脅從而導致產量下降、品質受損甚至樹體死亡外，西洋梨還抗寒性差且不耐高溫，影響其商業(yè)化生產，雖然20世紀90年代就已引入，但目前我國的種植規(guī)模有限，仍有較大發(fā)展空間。

利用育種手段進行抗性改良是提高作物品種抗逆性的有效方法。傳統(tǒng)的抗性改良方法是通過與野生種雜交進行抗性性狀和有利性狀的轉移，但梨樹具有高度雜合性和較長童期，導致其抗性雜交育種困難，育種周期長。芽變選種也是果樹新品種選育的一種有效方法，但芽變多表現株型或顏色的變異，很難發(fā)生抗性突變。通過離體葉片不定梢再生的遺傳轉化操作可以把抗性基因或目的基因直接轉移到無性繁殖的待改良果樹品種中，從而提高育種效率。西洋梨組織培養(yǎng)和不定梢再生研究國內外有些報道[2-6]，但較少，且不同品種適宜的組培條件也不同，尚未見國內外有關‘紅考密斯品種組織培養(yǎng)及離體葉片不定梢再生的研究。本研究對‘紅考密斯試管苗建立和增殖、葉片不定梢再生、試管苗生根的適宜組培條件進行試驗和篩選，以建立‘紅考密斯梨的組培快繁技術體系，滿足建園對優(yōu)質苗木的需求，同時建立其離體葉片不定梢再生體系，為利用生物技術手段改良這一品種、培育具有自主知識產權的新品種奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東省果樹研究所試驗基地種植的‘紅考密斯梨結果大樹。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌試管苗的建立 5月中旬剪取當年生半木質化新梢，剪掉葉片，把枝條剪成一芽一段的芽段，去掉新梢頂端尚未木質化的幼嫩部分。按孫清榮等[7]報道的外植體消毒流程對芽段外植體進行殺菌消毒，用無菌水沖洗5次，置無菌濾紙上吸去表面水分，植入裝有腋芽啟動培養(yǎng)基的試管內，一管一芽段。腋芽啟動培養(yǎng)基為1/2MS（無機鹽半量），其余為MS全量，然后加1 mg·L-1 6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、0.4 mg·L-1 吲哚丁酸（IBA）及30 g·L-1 蔗糖，調pH值為5.8，滅菌，然后在（25±2）℃、光照強度40 μmol·m-2·s-1 、光照周期16 h·d-1 條件下培養(yǎng)。

1.2.2 試管苗的增殖 將腋芽萌發(fā)獲得的無菌試管苗轉移到增殖培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)。設4種增殖培養(yǎng)基處理：（1）MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA；（2）MS+0.1 mg·L-1 TDZ（噻苯隆）+0.3 mg·L-1 IBA；（3）MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；（4）MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT（6-糠基氨基嘌呤）+0.3 mg·L-1 IBA。每處理接種3瓶，每瓶接種5個外植體，每一繼代周期為4周，繼代培養(yǎng)3次，觀察生長表現并記錄每個周期的增殖梢數，以3次繼代增殖梢數的平均值作為一個繼代周期的增殖倍數。

1.2.3 葉片不定梢再生 挑選增殖培養(yǎng)基上生長健壯的綠苗，切取其頂端展開的幼嫩葉片，用無菌刀片垂直于葉片中脈橫切3～5個傷口（依據葉片大小且方便操作）。將切傷后的葉片接種于不定梢誘導培養(yǎng)基上。不定梢誘導培養(yǎng)基以NN69為基本培養(yǎng)基，均添加0.3 mg·L-1 IBA和30 g·L-1 蔗糖，并分別添加細胞分裂素物質6-BA（2 mg·L-1 和4 mg·L-1 ）和TDZ（1 mg·L-1 和2 mg·L-1 ），共構成4個處理。每個處理接種3瓶，每瓶接種10個葉片，重復2次。葉片接種后放完全黑暗條件下連續(xù)培養(yǎng)4周，然后轉到光照周期為16 h·d-1 條件下培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)6周時，觀察記錄每個處理產生不定梢的葉片數，計算葉片不定梢再生率。葉片不定梢再生率=產生不定梢葉片數/接種總葉片數×100%。

1.2.4 試管苗生根 將腋芽萌發(fā)和葉片再生不定梢獲得的綠苗在4號壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取生長到1.5 cm以上的健壯綠梢轉移到生根培養(yǎng)基誘導生根。生根培養(yǎng)基以1/4MS無機鹽或1/2 MS無機鹽為基本培養(yǎng)基，分別添加0.3 mg·L-1 或0.5 mg·L-1 NAA，共構成4 種處理，各處理均加20 g·L-1 蔗糖。每個處理接種5瓶，每瓶種植10個梢，重復2次。接種后放暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d，然后轉到光照周期為16 h·d-1 條件下培養(yǎng)4周，統(tǒng)計生根梢數并計算生根率和平均每株根數。

1.3 統(tǒng)計分析

所得數據用DPS v3.01軟件統(tǒng)計分析，采用Tukey法進行差異比較。

2 結果與分析

2.1 試管苗的建立和增殖

芽段接種2周即可觀察到腋芽萌發(fā)（圖1A），接種4周，腋芽生長成為無菌小梢（圖1B）。將小梢轉移到增殖培養(yǎng)基上繼代增殖，結果發(fā)現在同時加6-BA和TDZ的3號增殖培養(yǎng)基上既有較好的增殖生長又有良好的伸長生長，且梢頂端有較伸展的葉片（圖1D），為最適宜的增殖培養(yǎng)基。單加6-BA的1號培養(yǎng)基，雖然伸長生長較好，但伸長莖的中段為基本看不到葉片的光禿部分，且梢頂端葉窄小不伸展并有頂梢枯死現象（圖1 C）。單加TDZ的2號培養(yǎng)基，伸長生長良好，葉片大而伸展，但表現不增殖（圖1E）。同時加6-BA和KT的4號培養(yǎng)基，伸長生長良好，但梢上半部分呈棒狀，葉窄小，伴有頂梢枯死現象（圖1 F）。

綜合比較‘紅考密斯梨在4種增殖培養(yǎng)基上的生長表現，細胞分裂素物質6-BA和TDZ并用的繼代增殖效果最佳，表現為既有良好的增殖生長又有良好的伸長生長；6-BA或TDZ單獨使用或6-BA和KT并用都不是最佳增殖培養(yǎng)基。但當用于葉片培養(yǎng)取葉或壯苗生根誘導取苗為目的時，單加 TDZ是壯苗和葉片培養(yǎng)的最適宜繼代培養(yǎng)基（表1）。

2.2 葉片不定梢誘導

細胞分裂素物質6-BA比TDZ更有利于提高‘紅考密斯葉片不定梢再生率，添加6-BA的再生率顯著高于添加TDZ的，且不依賴于6-BA和TDZ的濃度（表2）。

各處理的單位葉片不定梢數都表現較低，雖然添加TDZ的略高于添加6-BA的，但平均每葉梢數都低于2個。表明在試驗培養(yǎng)基上，‘紅考密斯梨葉片雖然可以獲得較高的不定梢再生率，但每葉只能產生1～2個不定梢。

在添加6-BA或TDZ的培養(yǎng)基上誘導產生的不定芽，在不定芽誘導培養(yǎng)基上可直接形成節(jié)間伸長生長的不定梢（圖2A和B），但添加6-BA形成的不定梢葉伸展，苗較高較壯（圖2A），而添加TDZ形成的不定梢葉不伸展，梢較矮較弱（圖2B）。表明6-BA比TDZ更適宜于誘導產生較壯的不定梢。

綜合以上分析，‘紅考密斯梨離體葉片不定梢再生的最適宜誘導培養(yǎng)基為NN69+0.3 mg·L-1 IBA+2 mg·L-1 6-BA。

2.3 試管苗生根

2.3.1 培養(yǎng)基組成對試管苗生根的影響 基本培養(yǎng)基的無機鹽濃度顯著影響生根率和平均每株生根數；相同無機鹽濃度下，NAA不同添加濃度對生根率和平均每株生根數無顯著影響，以添加0.3 mg·L-1 NAA的略高（表3）。表明‘紅考密斯梨試管苗生根不依賴于NAA的濃度，但受MS基本培養(yǎng)基中無機鹽濃度的顯著影響，適當的鹽濃度更利于根的誘導。

2.3.2 培養(yǎng)基組成對根生長的影響 培養(yǎng)基中無機鹽濃度較高（圖2E和F）比較低（圖2C和D）時莖基部產生更多的愈傷，但過多的愈傷不利于移栽成活，因此用于生根移栽時，推薦用較低濃度無機鹽即1/4MS培養(yǎng)基。1/4MS培養(yǎng)基上雖然生根率較低，但根基部產生的愈傷較少，易于移栽成活。

3 討論與結論

根據報道，適宜東方梨品種‘金花、‘豐水和‘幸水、‘黃金、‘新梨7號、‘黃冠梨增殖的基本培養(yǎng)基分別為LE、WPM、ASH、AS和MS，添加的細胞分裂素物質都是6-BA，僅6-BA的濃度因品種的不同而不同[8-12]。另有研究表明，6-BA誘導‘豐水和‘幸水獲得正常健壯增殖苗，而TDZ誘導產生玻璃化增殖苗[13]。適宜西洋梨品種‘豐產增殖的培養(yǎng)基為加6-BA的MS培養(yǎng)基[5]，而對于‘巴梨（Bartlett）和寶斯克（Beurre Bosc）兩品種則表現以基本培養(yǎng)基DKW 和QL的增殖效果優(yōu)于MS和WPM[3]。本研究中，同時加6-BA和TDZ的MS培養(yǎng)基可較好誘導‘紅考密斯梨增殖，但單加TDZ更適宜誘導有良好葉片伸展的壯苗。

本研究結果表明，細胞分裂素物質6-BA比TDZ更有利于提高西洋梨品種‘紅考密斯的葉片不定梢再生率，這與6-BA能有效提高西洋梨‘豐產、‘安久、‘紅安久梨葉片不定梢再生率的結果相一致[9，14]，但不同于已報道的其他西洋梨品種，如對于‘Louise Bonne Panachee和‘Seckel兩品種，TDZ比6-BA更有效[2，15]；對于‘考密斯，誘導培養(yǎng)基單加TDZ比同時加BA和IBA顯著提高再生率，最高再生率為70.8%[4]。Bell等[16]對22個西洋梨基因型的研究表明，西洋梨葉片不定梢再生率在0～87.7%之間，基因型是影響其不定梢再生及再生率高低的關鍵因素。

雖然報道成功獲得葉片不定梢再生的西洋梨品種已有多個，但多數品種的平均每葉不定梢數很少。本研究中‘紅考密斯梨每葉平均不定梢數也較少，最高僅為1.8個，且不定梢多產生于葉片中脈切口處，這與Bell等[16]的研究結果相似，均證明西洋梨離體葉片誘導雖然可以獲得較高的不定梢再生率，但想獲得較高的單位葉片不定梢數較困難。因此，如何提高單位葉片不定梢數需要進一步研究。

參 考 文 獻：

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