康復(fù)新液對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞保護(hù)作用的研究

王雄 黃艷麗 錢(qián)麗潔

[摘要]目的：觀察康復(fù)新液對(duì)中波紫外線（UVB）照射損傷后皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法：采用UVB輻射HaCaT細(xì)胞進(jìn)行造模，分為空白組、模型組、藥物組?？瞻捉M不給予處理，模型組、藥物組分別予不同劑量UVB輻射，藥物組在模型組基礎(chǔ)上給予康復(fù)新液。以CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖活力，酶生化法測(cè)定過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶含量。結(jié)果：與模型組比較，同等UVB劑量下藥物組乳酸脫氫酶含量下降（P<0.01），超氧化物歧化酶含量及細(xì)胞增殖活力升高（P<0.01）。結(jié)論：康復(fù)新液可通過(guò)減輕UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷，從而達(dá)到對(duì)HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]康復(fù)新液；中波紫外線；皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞；保護(hù)作用；光老化；超氧化物歧化酶

[中圖分類(lèi)號(hào)]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）11-0145-03

Abstract： Objective To observe the protective effect of Kangfuxin Solution on photoaging Human Keratinocytes （HaCaT cells） induced by ultraviolet radiation B （UVB）， and explore its underlying mechanism. Methods The models of photoaging HaCaT cell were established by UVB radiation， which were divided into blank group， model group and drug group， respectively.The blank group was not treated， the model group and the drug group were given different doses of UVB radiation， while the drug group was given the kangfuxinye on the basis of the model group， and then the cell proliferation activity was measured by CCK8. The contents of catalase， superoxide dismutase and lactate dehydrogenase were measured by enzyme biochemical method. Results Compared with the model group of the same UVB dose， the level of lactate dehydrogenase in the drug group was lower（P<0.01）， while the contents of superoxide dismutase， catalase and cell proliferation increased （P<0.01）. Conclusion Kangfuxin Solution has the protective effect on HaCaT cells by inhibiting the damage of UVB to HaCaT cells.

Key words： kangfuxinye； UVB； HaCaT cells； protective effect； light aging； superoxide dismutase

康復(fù)新液主要組分為美洲大蠊干燥蟲(chóng)體的乙醇提取物，有去腐生肌，改善創(chuàng)面微循環(huán)，消除炎癥水腫和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[1-2]，其抗氧化作用可提高淋巴細(xì)胞及血清溶菌酶的活性，使體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）值上升，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理平衡[3-4]。但尚未見(jiàn)抗皮膚角質(zhì)細(xì)胞紫外線損傷的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞），以不同劑量中波紫外線（ultraviolet light in medium waves， UVB）照射建立細(xì)胞模型，觀察康復(fù)新液對(duì)UVB損傷光老化HaCaT細(xì)胞的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：本試驗(yàn)主要試劑有：康復(fù)新液（湖南科倫制藥有限公司，國(guó)藥批號(hào)Z43020995）；HaCaT細(xì)胞（武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司）；胎牛血清（Bovogen公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；PBS（Hyclone公司）；CCK8（Cell Counting Kit-8，日本同仁公司）；SOD試劑盒、過(guò)氧化物酶（Catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物科技）。主要實(shí)驗(yàn)儀器：UVB光療儀（Sigma公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀等（Bio-Rad公司）。

1.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置CO2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)條件5% CO2、飽和濕度、37℃）中培養(yǎng)。

1.3 UVB誘導(dǎo)細(xì)胞老化：參考相關(guān)文獻(xiàn)建立細(xì)胞光老化模型[5-6]：UVB照射前1d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，使其匯合度為50%～70%。照射前將培養(yǎng)液吸去，PBS緩沖液沖洗1次，再加入少量PBS緩沖液覆蓋照射細(xì)胞上層，以UVB光源照射。

1.4 分組及干預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)分為空白、模型組、藥物組。空白組：HaCaT細(xì)胞不給予康復(fù)新液，同時(shí)也不進(jìn)行UVB照射；模型組：HaCaT細(xì)胞僅進(jìn)行UVB照射，照射劑量分別為10mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2；藥物組：細(xì)胞經(jīng)UVB照射處理后再加入康復(fù)新液。照射完后，吸棄PBS，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，獲細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：將HaCaT細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組干預(yù)方法處理細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK-8溶液10?1，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育，孵育4h后在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。計(jì)算細(xì)胞存活率公式為：（A藥物組-A空白組）/（A模型組-A空白組）×100%。

1.6 LDH、SOD活性及CAT含量檢測(cè)：HaCaT細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組干預(yù)方法處理細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集上清液檢測(cè)LDH含量，收集細(xì)胞檢測(cè)CAT、SOD和CAT含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x?±s）表示，組間差異采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞LDH、SOD、CAT及增殖率影響：UVB劑量為0即為空白組，與空白組相比，隨著UVB照射強(qiáng)度增加，模型組HaCaT細(xì)胞增殖率逐漸降低（P<0.01），細(xì)胞SOD及CAT活性逐漸降低，LDH含量逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 康復(fù)新液對(duì)不同劑量光損傷HaCaT細(xì)胞的作用：與模型組同等UVB輻射劑量下相關(guān)指標(biāo)比較（見(jiàn)表1），藥物組LDH含量下降（P<0.05），SOD、CAT含量及細(xì)胞增殖活力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

光老化是由于皮膚暴露于UV下而造成的慢性損傷，主要涉及UV誘導(dǎo)活性氧簇產(chǎn)生、蛋白激酶信號(hào)通路活化、金屬蛋白酶類(lèi)表達(dá)以及加重炎癥反應(yīng)等，使表皮異常增生、真皮膠原結(jié)構(gòu)改變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥松弛、皺紋深而多、彈性下降以及色素沉著等[7]，不僅有損皮膚美容，與部分皮膚癌變疾病也有密切關(guān)系。目前對(duì)皮膚衰老的研究主要是對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞衰老的研究。

波長(zhǎng)290～320nm的UVB主要作用于表皮，使角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，誘發(fā)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶含量下降，其產(chǎn)物丙二醛、LDH含量增加，導(dǎo)致更多ROS的產(chǎn)生，以正反饋形式加劇皮膚組織和細(xì)胞的損傷。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一系列抗過(guò)氧化物酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加、清除能力下降和抗氧化能力減弱時(shí)可致細(xì)胞氧化損傷[8-9] 。國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)皮膚光老化的客觀標(biāo)準(zhǔn)主要是檢測(cè)衰老皮膚與正常皮膚中的與氧化相關(guān)物質(zhì)（包括測(cè)定SOD、GSH-Px、LDH、CAT、GSH含量和MDA水平）是否存在差異[10-11]。當(dāng)細(xì)胞膜受氧化攻擊受損時(shí)，LDH可能通過(guò)細(xì)胞膜滲出，間接反應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激受損程度。

康復(fù)新液是提取美洲大蠊體內(nèi)的活性物質(zhì)而成，主要成分為多元醇類(lèi)及肽類(lèi)活性物質(zhì)，含有18種氨基酸，能夠去腐生肌、改善微循環(huán)，消除炎癥、水腫和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[4]，還有促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，抗氧化、清除自由基，抗衰老作用[12-13]。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比空白組和模型組發(fā)現(xiàn)隨著UVB照射強(qiáng)度增加，HaCaT細(xì)胞增殖率逐漸降低，細(xì)胞SOD及CAT活性逐漸降低、LDH含量逐漸增加，本次實(shí)驗(yàn)光老化模型建立成功。當(dāng)實(shí)驗(yàn)加入康復(fù)新液后，對(duì)比同等UVB劑量下的模型組，發(fā)現(xiàn)SOD及CAT活性明顯提高，LDH含量降低，UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用減輕，細(xì)胞存活率提高。說(shuō)明康復(fù)新液可以對(duì)抗UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞膜損傷，保護(hù)細(xì)胞膜完整性。因此，筆者推測(cè)康復(fù)新液保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用與其抗氧化、清除自由基有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)康復(fù)新液對(duì)3種不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，康復(fù)新液通過(guò)提高細(xì)胞中SOD、CAT的活性，降低了LDH漏出量，從而達(dá)到抗皮膚光老化的作用，關(guān)于不同濃度康復(fù)新液對(duì)光損傷細(xì)胞的保護(hù)作用及其具體分子機(jī)制，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2018-08-15 [修回日期]2018-11-01

編輯/賈敏