液態(tài)培養(yǎng)條件下煙曲霉去除Cd的研究

陳耀寧+汪元南+黎媛萍+陳艷容+茍宇+朱福造+張道利+劉耀

摘 要：研究了一株高耐Cd的煙曲霉在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)條件下對(duì)不同濃度Cd的去除效果，測(cè)定了其在去除過程中菌株產(chǎn)谷胱甘肽 （GSH） 的變化.結(jié)果表明，在重金屬Cd濃度為50 mg/L時(shí)，煙曲霉去除Cd效率最佳，達(dá)到55.5%的去除率，其產(chǎn)生的GSH濃度達(dá)到了0.89 μmol/mg.研究比較了不同環(huán)境條件下煙曲霉對(duì)Cd的去除效率，發(fā)現(xiàn)在溫度30 ℃，pH 5.0，加液量120 mL，轉(zhuǎn)速100 r/min，接種量0.4 mL（1.0×107 CFU/mL）的培養(yǎng)條件下，煙曲霉能達(dá)到最佳去除Cd的效率.通過這種培養(yǎng)條件的優(yōu)化，煙曲霉較初始條件下對(duì)50 mg/L Cd的去除率提高了29.8%，培養(yǎng)體系中GSH濃度增加了0.42 μmol/mg.谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽還原酶（GR）的變化表明煙曲霉在優(yōu)化的液態(tài)生長(zhǎng)環(huán)境下可以較好去除培養(yǎng)體系中的重金屬Cd，其產(chǎn)生的GSH對(duì)Cd的去除有促進(jìn)作用，其解毒機(jī)制可能是依靠體內(nèi)GPX和GR將應(yīng)激產(chǎn)生的氧化性物質(zhì)去除來實(shí)現(xiàn).

關(guān)鍵詞：煙曲霉；谷胱甘肽；液體培養(yǎng)；鎘；去除

中圖分類號(hào)：X506 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on Removal of Cd by Aspergillus fumigatus in Liquid Culture

CHEN Yaoning1，2 ，WANG Yuannan1，2，LI Yuanping3，CHEN Yanrong1，2，

GOU Yu1，2，ZHU Fuzao1，2，ZHANG Daoli1，2，LIU Yao1，2

（1.College of Environmental Science and Engineering，Hunan University，Changsha 410082，China；

2.Key Laboratory of

Environmental Biology and Pollution Control（Hunan University），Ministry of Education，Changsha 410082，China；

3.College of Municipal and Mapping Engineering，Hunan City University，Yiyang 413000，China）

Abstract：The removal efficiency of a Cd-resistant Aspergillus fumigatus under different concentrations of Cd in laboratory flask culture was studied，and the changes of glutathione （GSH） production in the strain were determined. The results showed that the removal rate of Cd was 55.5% when the concentration of Cd was 50 mg/L，and the concentration of GSH was 0.89 μmol/mg. The comparison of Cd removal efficiency by Aspergillus fumigatus under different conditions showed that the optimal condition was 30 ℃，pH value of 5.0，add fluid volume of 120 mL，speed of 100 r/min，and inoculation amount of 0.4 mL （1.0×107 CFU/mL）. Under the optimal condition，the removal rate of Cd was 29.8% higher than that under the initial condition，and the GSH content in the culture system was increased by 0.42 μmol/mg. Thechanges of glutathione peroxidase （GPX） and glutathione reductase （GR） indicated that Aspergillus fumigatus could remove the heavy metal Cd in the culture system under the optimized liquid growth conditions，GSH could promote the removal of cadmium，and its detoxification mechanism could be achieved by removing the oxidative substances produced by stress by GPX and GR in vivo.

Key words：Aspergillus fumigatus； glutathione； liquid culture； cadmium； removal

重金屬的使用量隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的快速發(fā)展不斷增多，其在污染環(huán)境的同時(shí)還導(dǎo)致資源嚴(yán)重短缺.重金屬不能被生物降解，但可通過一系列生物鏈的傳遞在生物體內(nèi)富集，嚴(yán)重威脅到人類的生產(chǎn)和生活，因而高效處理水體中重金屬勢(shì)在必行.鎘是一種毒性很大的重金屬，其化合物也大多屬于毒性物質(zhì)，極其微量的鎘就可對(duì)人體造成傷害，震驚世界的日本“痛痛病”就是水田鎘污染的典型事例[1].在中國(guó)土壤重金屬污染狀況也十分嚴(yán)重，如2013年5月“鎘大米”事件、2014年廣西大新縣重金屬污染事件等等[2].根據(jù)我國(guó)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部2014年4月發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》可知，全國(guó)土壤重金屬的超標(biāo)率為16.1%，其中重金屬鎘的超標(biāo)率為7.0%，為首要污染物.我國(guó)農(nóng)田重金屬鎘污染面積高達(dá)2萬hm2，鎘含量超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品年產(chǎn)量高達(dá)14.6億kg[3].可見我國(guó)重金屬鎘污染的嚴(yán)重性及廣泛性.endprint

水體重金屬污染的傳統(tǒng)處理方法有沉淀法、反滲透法、電滲析法、離子交換法和氧化還原法等[4]，但是這些方法成本高、能耗高，會(huì)產(chǎn)生二次污染，重金屬濃度為1～100 mg/L時(shí)成本較高[5]，難以很好地解決重金屬回收和水資源再利用的問題.生物吸附有著價(jià)廉易得、易操作、選擇性好、吸附速率快和吸附量大等優(yōu)點(diǎn)，其中微生物更是被廣泛用于水體重金屬吸附的研究和實(shí)踐[6-11].

有研究表明，包括藻類[6-7]、細(xì)菌[8-11]和真菌[12-14]在內(nèi)的微生物體能用于降低水體中重金屬含量，其中真菌有著較強(qiáng)的吸附能力，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)吸附去除較多重金屬，其細(xì)胞表面有多種基團(tuán)還可以通過配位結(jié)合重金屬離子[15].煙曲霉作為大型真菌中曲霉屬的一種，對(duì)重金屬有著較強(qiáng)的耐受性[16]，其胞外聚合物對(duì)水體重金屬吸附[17-18]和胞外產(chǎn)有機(jī)酸對(duì)土壤重金屬淋濾[19]的研究已有一些報(bào)道，但將生長(zhǎng)中的煙曲霉活體作為一種重金屬吸附材料還少有報(bào)道.由于活體真菌生長(zhǎng)受環(huán)境影響較大[20-22]，對(duì)其在不同環(huán)境條件去除Cd的研究有助于推動(dòng)活體真菌去除水體重金屬的研究和實(shí)踐.

谷胱甘肽系統(tǒng)是生物體內(nèi)主要的抗氧化防御體系，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及機(jī)體的解毒代謝中起重要作用.重金屬刺激菌體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫和過氧自由基等氧化物，還原性谷胱甘肽（GSH）不僅可以與這些氧化物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，還能與金屬離子通過復(fù)雜絡(luò)合反應(yīng)形成復(fù)合物而將重金屬排出體外[23]，從而支持機(jī)體抵御不利環(huán)境條件.有研究證實(shí)稀土離子可以與GHS兩端的羥基負(fù)離子結(jié)合[24]，有些金屬離子能與GSH中的巰基進(jìn)行相互作用形成配合物[25].谷胱甘肽過氧化酶（GPX）可將過氧化物在GSH的作用下轉(zhuǎn)化成毒性很小的羥基衍生物，GSH在此過程中被轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），而GSSG可由谷胱甘肽還原酶（GR）催化重新還原成為GSH[26].目前，關(guān)于Cd刺激煙曲霉產(chǎn)GSH的相關(guān)研究還沒有報(bào)道過.

本實(shí)驗(yàn)選用一株煙曲霉，研究了液體培養(yǎng)條件下活體煙曲霉對(duì)不同濃度鎘的去除效果，進(jìn)而優(yōu)化了煙曲霉去除鎘的液體培養(yǎng)條件，測(cè)定了不同條件下煙曲霉產(chǎn)GSH的變化，以期尋找煙曲霉去除Cd的較優(yōu)液態(tài)培養(yǎng)條件，揭示Cd去除與GSH變化的關(guān)系，并通過結(jié)合谷胱甘肽相關(guān)酶了解GSH在此過程中的解毒機(jī)制，為活體真菌去除重金屬的相關(guān)研究提供有益參考.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

煙曲霉（Aspergillus fumigatus），購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC 3.7795）.將菌種于土豆瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）30 ℃培養(yǎng)5 d，刮取少量孢子于無菌水中充分震蕩，調(diào)節(jié)體積制備孢子濃度約為1.0×107 CFU/mL的菌懸液.

1.1.2 培養(yǎng)基

土豆瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）配方：新鮮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL.

真菌液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，蒸餾水1 000 mL.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于250 mL錐形瓶中加入真菌液體培養(yǎng)基100 mL，稱取適量硝酸鎘，分別制備鎘濃度為20，50，100和200 mg/L的液體培養(yǎng)基，用0.1 mol/L HNO3調(diào)節(jié)pH為5.0，再接種以上菌懸液1 mL于錐形瓶中，置于150 r/min，25 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)，3 d后取樣，8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定剩余Cd濃度[27].

通過上述試驗(yàn)確定煙曲霉最適鎘去除濃度后，進(jìn)行液體吸附培養(yǎng)條件的優(yōu)化：首先設(shè)置pH為3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]其它初始條件設(shè)置為轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度25 ℃，加液量100 mL，菌種接種量1 mL進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，取樣測(cè)定鎘濃度后確定最優(yōu)pH值，然后采用同種方法逐一對(duì)溫度（10，20，25，30和37 ℃）、轉(zhuǎn)速（100，120，150，180和200 r/min）、加液量（即液體培養(yǎng)基體積：30，50，70，100和120 mL）、菌懸液加入量（0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 mL）開展優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每一步參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)均采用已經(jīng)確認(rèn)優(yōu)化過參數(shù)值，逐步對(duì)未優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行考察.最后選定優(yōu)化的條件再次對(duì)不同濃度Cd下的去除效果進(jìn)行驗(yàn)證.上述不同條件吸附試驗(yàn)均在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行，接種3 d后取樣，8 000 r/min離心10 min，上清液稀釋100倍后于原子吸收光譜儀（AAS）上測(cè)定液體培養(yǎng)基中鎘的濃度.根據(jù)吸附前后鎘濃度差計(jì)算煙曲霉對(duì)鎘的去除率：

去除率（%）= （C0-C1）/C0 × 100%

式中：C0為重金屬初始濃度；C1為經(jīng)菌體吸附后剩余重金屬濃度.

1.2.2 GSH的測(cè)定

取離心后的菌體50 mg，用5 mL無菌生理鹽水（0.85% NaCl）仔細(xì)沖洗兩次，于4 000 r/min下離心10 min，濕菌體用40%乙醇于60 ℃下水浴2.5 h，然后于4 ℃，5 000 r/min下離心20 min，上清液過0.45 μm濾膜，濾液采用紫外分光光度法測(cè)定GSH的濃度[28].

1.2.3 抗氧化酶的測(cè)定

新鮮菌體用去離子水沖洗2次，然后在濾紙上吸干水，準(zhǔn)確稱取50 mg菌絲體在液氮上研磨，再在12 000g離心10 min，上清液作為用于酶活性測(cè)定的酶液.GR活性參考Smith的測(cè)定方法[29]，反應(yīng)混合物1 mL中含100 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），1 mmol/L GSSG，60 μmol/L NADPH和上清液，反應(yīng)300 s后于340 nm下測(cè)定.GPX活性的測(cè)定參考Flohe的測(cè)定方法[30]，反應(yīng)體系含0.2 mL 1.0 mmol/L GSH（含2.5 mmol/L NaN3）和酶液0.2 mL，由37 ℃預(yù)熱的1.5 mmol/L H2O2 0.1 mL 啟動(dòng)反應(yīng)， 37 ℃水浴中反應(yīng)180 s，加2 mL 1.67% 的偏磷酸沉淀蛋白質(zhì)，5 000g離心20 min，取1.25 mL上清液混合0.25 mL DTNB 5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），反應(yīng)300 s后于422 nm下測(cè)酶活定.每組實(shí)驗(yàn)做3次平行取平均值.endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 煙曲霉對(duì)不同重金屬Cd的去除率及其產(chǎn)GSH含量的影響

重金屬Cd有較強(qiáng)的低離子毒性效應(yīng)，煙曲霉對(duì)不同濃度Cd的去除效果及其GSH含量的變化如圖1所示.從圖中可以看出除Cd濃度為200 mg/L外，煙曲霉對(duì)水體中重金屬Cd的去除效果約為50%，且當(dāng)Cd的濃度為50 mg/L時(shí)，去除率最大，為55.5%，而GSH含量為0.89 μmol/mg，在Cd濃度從50 mg/L升高到200 mg/L過程中含量逐漸下降，這與Xu的研究結(jié)果類似[31]，表明Cd能抑制GSH的總量，Cd濃度越大，這種抑制作用越強(qiáng).煙曲霉對(duì)Cd的較適去除濃度為50 mg/L，高于此濃度，特別是當(dāng)濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，去除率明顯下降，由于Cd在高濃度時(shí)對(duì)煙曲霉有毒害作用，且重金屬濃度越高，這種毒性作用越強(qiáng)，菌體生長(zhǎng)受到抑制，從而產(chǎn)生的GSH含量下降，進(jìn)而抑制菌體對(duì)重金屬Cd的去除效果[32].

2.2 pH對(duì)煙曲霉去除重金屬及其產(chǎn)GSH含量的影響

pH能影響細(xì)胞表面的金屬吸附位點(diǎn)和金屬離子的存在形態(tài)，對(duì)真菌吸附重金屬起十分重要的作用[4].不同微生物對(duì)不同重金屬離子的最佳去除pH不同，如固定化青霉吸附Pb2，Cu2+的最佳pH約為5.5[33]，黑曲霉吸附Pb2+的最佳pH為5，吸附Cd2+時(shí)則為3[34].圖2所示為不同pH下煙曲霉去除Cd和GSH含量的變化，從剩余Cd含量可以看出當(dāng)pH為5時(shí)，去除率和GSH含量均達(dá)到最大值，分別為51.2%和0.89 μmol/mg.pH為3時(shí)去除效果不佳，可能原因是水合氫離子占據(jù)了菌體表面重金屬的吸附位點(diǎn)，產(chǎn)生斥力作用阻礙重金屬離子接近細(xì)胞壁.

當(dāng)pH為7時(shí)，去除效率下降，這可能是此時(shí)pH超過了菌體最適生長(zhǎng)條件，使得菌體對(duì)水體中重金屬Cd的去除率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì).另外，本研究中GSH含量與重金屬去除率的變化趨勢(shì)基本相同，當(dāng)pH為4～6時(shí)，GSH含量均大于0.80 μmol/mg，較低和較高pH時(shí)，GSH含量均降低，這可能是因?yàn)閜H 4～6是煙曲霉的較適生長(zhǎng)pH值，在其它pH環(huán)境下，菌體的生長(zhǎng)都受到了影響，產(chǎn)生的GSH也較少.

2.3 溫度對(duì)煙曲霉去除Cd及產(chǎn)GSH含量的影響

微生物均有最適生長(zhǎng)溫度，溫度過高或者過低都會(huì)影響生長(zhǎng)，進(jìn)而影響對(duì)重金屬的吸附效果.圖3為不同溫度下煙曲霉對(duì)Cd去除率及GSH含量的影響.在15～37 ℃時(shí)，煙曲霉對(duì)Cd去除率變化不是很大；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，重金屬的去除率最大；但在15 ℃時(shí)，GSH含量卻明顯較低，可能是因?yàn)樵诖藴囟认拢婢钚允艿揭欢ǔ潭鹊囊种?，從而GSH含量較低；而當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，GSH含量總體上也維持在0.9 μmol/mg.

2.4 加液量對(duì)煙曲霉去除Cd及產(chǎn)GSH含量的影響

加液量也是影響微生物吸附重金屬一個(gè)重要的參數(shù)，圖4為不同加液量對(duì)煙曲霉吸附水體中Cd及產(chǎn)GSH含量的影響.由圖可以看出隨著加液量的增加，煙曲霉對(duì)重金屬的去除率逐漸增加，并在加液量為120 mL時(shí)達(dá)到最大值，最大去除率為50.4%，在加液量為50和70 mL時(shí)，去除率相差不大，但是GSH含量卻相差較大，后者比前者GSH增加了18%，可能原因?yàn)楫?dāng)加液量為50 mL時(shí)，微生物的生長(zhǎng)空間受到限制，從而使得微生物生長(zhǎng)量較少；相反，當(dāng)加液量為70 mL時(shí)，則有利于微生物生長(zhǎng)，微生物的生物量增加，從而分泌的GSH含量也對(duì)應(yīng)增加.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置在250 mL錐形瓶中完成，過高加液量會(huì)影響振蕩和培養(yǎng)基供氧，綜合比較設(shè)置所考察的最大加液量為120 mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明此為最適加液量.

2.5 轉(zhuǎn)速對(duì)煙曲霉去除Cd及產(chǎn)GSH含量的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)煙曲霉去除Cd和產(chǎn)GSH含量的影響如圖5所示.隨著轉(zhuǎn)速的增加，煙曲霉對(duì)Cd的去除先增加后減少，100 r/min條件下的去除率與120 r/min較為接近，去除率約為49%.綜合考慮100 r/min培養(yǎng)條件為最佳轉(zhuǎn)速，200 r/min時(shí)去除率只有41.5%，相應(yīng)的產(chǎn)GSH含量也最低，可能是因?yàn)閯×业臋C(jī)械攪拌產(chǎn)生了較強(qiáng)的剪切作用，并且促使渦流顯現(xiàn)，破壞了吸附的均質(zhì)性，影響菌株生長(zhǎng)，從而使去除率下降[35].

2.6 不同接種量對(duì)煙曲霉去除Cd及其GSH含量的影響

接種量的多少會(huì)影響菌體在液態(tài)基質(zhì)中的生長(zhǎng)量變化，從而可能間接影響菌體對(duì)重金屬的吸附效果.本研究中不同接種量下煙曲霉去除Cd及產(chǎn)GSH含量的變化如圖6所示.可以看出，煙曲霉對(duì)水體Cd的去除率基本穩(wěn)定在50%左右，當(dāng)接種量為0.4 mL（1.0×107 CFU/mL）時(shí)，GSH含量最大為1.20 μmol/mg，這比接種量為0.1 mL時(shí)高57%，而比接種量為0.8 mL時(shí)高47%，該接種量下剩余重金屬濃度含量最低，表明相應(yīng)的去除率相對(duì)高于其他組，這說明并不是菌懸液接種量越大越好，只有接種適量的菌懸液才能獲得最佳的去除效果.造成去除率變化不大的原因是由于培養(yǎng)條件相同下，菌體呈對(duì)數(shù)快速增長(zhǎng)，菌體生物量能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到受營(yíng)養(yǎng)條件控制的穩(wěn)定水平，因而對(duì)溶液中Cd的去除差別不大.而GSH含量在接種量為0.4 mL時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)剩余Cd的含量最少，可能是這種接種量條件下，菌體的增值代謝和產(chǎn)生GSH的時(shí)機(jī)最契合[36].

2.7 優(yōu)化條件下煙曲霉對(duì)重金屬的去除與產(chǎn)GSH含量的影響

通過以上分析，可以看出Cd去除率在pH和接種量所考察范圍內(nèi)呈現(xiàn)了先升后降的變化趨勢(shì)，最佳條件明顯.其他因素組合需要進(jìn)一步確認(rèn).考慮到實(shí)驗(yàn)量的因素，本次研究中選定了接種量為0.4 mL（1.0×107 CFU/mL），pH為5.0為最優(yōu)值，在此基礎(chǔ)上對(duì)其他參數(shù)選擇去除率較高的水平進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)了四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

由正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，Cd為50 mg/L，加液量為120 mL時(shí)菌體對(duì)水體中Cd的去除率最大，最大去除率為85.2%.選定以上正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件，驗(yàn)證煙曲霉對(duì)不同濃度重金屬Cd的去除效果，結(jié)果如表2所示.相對(duì)于初始設(shè)置下的結(jié)果（圖1），煙曲霉對(duì)Cd的去除率明顯提高，在濃度為50 mg/L時(shí)，去除率提高了29.80%，GSH含量增加了0.42 μmol/mg，直接觀察培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)菌體濃度明顯增加，這可能是Cd去除率和GSH含量增加的主要原因，即使在Cd濃度為200 mg/L時(shí)，去除率也達(dá)到了43.70%，提高了16.30%，此時(shí)GSH含量明顯低于低濃度Cd下GSH的含量，再次證實(shí)高濃度Cd對(duì)煙曲霉有明顯的抑制作用，且隨著重金屬濃度增加，這種抑制作用也在逐漸增加.endprint

2.8 優(yōu)化條件下煙曲霉產(chǎn)GPX和GR酶活變化

優(yōu)化條件下，煙曲霉在應(yīng)對(duì)Cd脅迫下產(chǎn)GPX和GR活性變化曲線如圖7所示.GPX的活性隨著Cd濃度增加而先升后降，在培養(yǎng)6 h和Cd為50 mg/L時(shí)，最大達(dá)到15.62 U/mg，且在Cd濃度為200 mg/L時(shí)，GPX活性含量較低，可能由于該高濃度Cd作用下體內(nèi)積累Cd過多，大量的Cd與Se-Cys結(jié)合導(dǎo)致GPX活性中心受到破壞，使酶酶活力下降.GSH在GPX催化作用下可將H2O2轉(zhuǎn)化為水而實(shí)現(xiàn)解毒，由表1 可知，二者變化趨勢(shì)基本吻合.

在培養(yǎng)前期（18 h前），Cd對(duì)GR無顯著影響（圖7）；而在此之后，GR活力開始隨Cd濃度的增大而下降.GR能將氧化性谷胱甘肽（GSSG）還原成GSH[26]，Cd濃度為50 mg/L時(shí)GR明顯比其他組高，這與GSH變化趨勢(shì)一致（表2）.

2.9 各因素之間的相互關(guān)系及與GSH的相互影響

本研究結(jié)果綜合表明所采用的培養(yǎng)體系下活體煙曲霉對(duì)水體Cd有一定的去除效果.由于活體菌體的生長(zhǎng)需要控制一定的環(huán)境條件，因而包括以上6種因素的環(huán)境條件會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生綜合影響，既是對(duì)菌體正常生長(zhǎng)的保證，盡可能多的菌體是對(duì)去除效果的基本保證.同時(shí)這些因素也是對(duì)去除效果的優(yōu)化，尤其是適度的Cd存在是對(duì)活體真菌產(chǎn)生GSH的有效刺激.所以這些因素對(duì)于我們的研究目標(biāo)，是相互關(guān)聯(lián)也是綜合作用的.而GSH的產(chǎn)生則依賴于菌體的正常生長(zhǎng)而分泌，因而本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件來保障菌體的生長(zhǎng)和對(duì)Cd濃度的去除.通過逐步篩選試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳組合條件為溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，Cd濃度為50 mg/L，加液量為120 mL，pH5.0，接種量為0.4 mL（1.0×107 CFU/mL）.由于Cd2+對(duì)菌體具有一定程度的毒性作用（圖1），濃度過高時(shí)，甚至?xí)?duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用[30]，不利于環(huán)境中Cd的去除.在適量Cd2+（50 mg/L）刺激下，菌體分泌的GSH增多并且不至于對(duì)菌體產(chǎn)生過度的抑制作用，更加有利于體系中Cd的去除，這同時(shí)也是菌體抵御不利的環(huán)境條件的解毒響應(yīng)[16].通過分析各種環(huán)境條件下去除率與GSH含量的變化，發(fā)現(xiàn)二者明顯正相關(guān).谷胱甘肽體系是生物體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)，因GSH與GSSG之間存在一定循環(huán)，之間有GPX和GR之間的相互轉(zhuǎn)化，而GSSG在整個(gè)過程中含量幾乎可以忽略，因研究主要考察GSH在培養(yǎng)過程中的變化，并且測(cè)定了GPX和GR在實(shí)驗(yàn)過程中的變化趨勢(shì)，以進(jìn)一步了解GSH的解毒機(jī)制，由2.8部分可以看出GSH的解毒機(jī)制可能是依靠體內(nèi)GPX和GR將應(yīng)激產(chǎn)生的氧化性物質(zhì)去除，進(jìn)而達(dá)到體內(nèi)的抗氧化效果，維持機(jī)體內(nèi)正常的穩(wěn)態(tài)環(huán)境[26].

3 結(jié) 論

1）煙曲霉在液態(tài)培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)下可以去除培養(yǎng)液中約50%的Cd，且在重金屬Cd濃度為50 mg/L時(shí)去除效果最好，達(dá)到55.5%.選用優(yōu)化的培養(yǎng)條件可以在Cd濃度為50 mg/L時(shí)將去除率提高29.8%.表明煙曲霉在優(yōu)化的液體培養(yǎng)條件下，其活菌體能以較高效率去除液體中的Cd.

2）煙曲霉在搖瓶中去除液體培養(yǎng)體系中Cd的較優(yōu)條件為溫度30 ℃，pH 5.0，加液量120 mL，轉(zhuǎn)速120 r/min，接種量0.4 mL（1.0×107 CFU/mL）.

3）GSH在煙曲霉活性生長(zhǎng)狀態(tài)下對(duì)Cd的去除發(fā)揮著重要作用，GSH含量的增加與Cd的去除呈正相關(guān)，GSH含量越大，去除率越高，反之則越小.GSH解毒是由GPX和GR將胞內(nèi)過多氧化性物質(zhì)氧化分解或者與Cd結(jié)合成螯合物排出體外來實(shí)現(xiàn).

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