高效液相色譜法測定飲料中B族維生素

忻欣，高飛，韓瑩，張宏偉，何悅

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.北京邁迪安生物科技有限公司，北京100022；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；4.北京檢驗檢疫檢測中心，北京100026）

B族維生素是很多重要酶的輔酶，缺乏將會導(dǎo)致與之相關(guān)的某些疾病的發(fā)生[1-2]，具最近研究報道，B族維生素具有一定的改善沮喪情緒的作用[3]，提高身體機能[4]的功能以及對糖尿病人的大腦的保護作用[5]。B族維生素人體無法自身合成，必須從食物中攝取[6]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中B族維生素的檢測方法為單獨一種維生素單獨測定，無法進行多種B族維生素同時檢測。如VB1采用高效液相色譜串聯(lián)熒光檢測器（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector，HPLC-FLD）的方法或者熒光分光光度計方法[7]，VB2采用HPLC-FLD或者熒光分光光度計方法[8]，VB6采用HPLC-FLD或者微生物方法[9]，VB12采用微生物方法或者高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器（High Performance Liquid Chromatography-UV Detector，HPLC-UV）方法[10-11]，煙酰胺采用微生物方法或者HPLC-UV方法[12]等等，由于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的方法無法同時測定多種B族維生素，不太適合用于日常產(chǎn)品品質(zhì)監(jiān)控。多種B族維生素同時檢測也逐漸成為研究熱點，具文獻報道，研究者常使用HPLC-UV/FLD法[13-15]，HPLC-化學(xué)發(fā)光法[16]和HPLC-MS法[17]等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法高效快速，但檢測成本高，高效液相色譜法對B族維生素可進行定性和定量分析，具有相對快速、分析靈敏度較高和回收率高等優(yōu)點，成為最常用的檢測方法。本研究建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確和靈敏的測定飲料中B族維生素的HPLC-UV方法，可在20 min內(nèi)一次性分析5種B族維生素。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀-紫外檢測器：美國安捷倫公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；（煙酰胺），（鹽酸吡哆醇）和VB12標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；色譜純甲醇、乙腈：德國默克公司；18 MΩ水由Milli-Q純水儀制。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：稱取適量的維生素標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：PhenomenexODS3C18柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：A超純水，B乙腈，C甲醇，洗脫梯度條件為：0 min～9 min，94%A，3%B，3%C；9 min～20 min，90%～80%A，10%～20%B；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長為 266 nm；進樣量：5 μL。

1.4 樣品前處理

取2 mL左右飲料樣品，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，收集濾液直接上樣。如樣品較為粘稠或維生素含量偏大可以使用超純水進行稀釋后經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，收集濾液直接上樣，含氣飲料事先進行30 min超聲脫氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的優(yōu)化

使用紫外分光光度計對標(biāo)準(zhǔn)樣品進行190 nm～400 nm波長掃描，VB1最大吸收波長為263 nm，VB2最大吸收波長為266 nm，煙酰胺最大吸收波長為262 nm，VB6最大吸收波長為291nm，VB12最大吸收波長為278nm，由于煙酰胺和VB6的出峰時間相近，因此無法進行波長調(diào)整，最終選擇266 nm作為檢測波長。

2.2 流動相體系的選擇

本研究對參考前人研究進行一系列流動相體系的選擇，通過調(diào)整流動相pH值、調(diào)整梯度范圍和調(diào)整有機溶劑的成分最終確定最佳的梯度洗脫程序。

磷酸二氫鉀和乙腈水溶液體系：對該體系進行梯度洗脫條件、pH值3～6和磷酸二氫鉀濃度[18-19]調(diào)整。試驗結(jié)果表明，無論原始參考文獻方法還是改進方法均容易出現(xiàn)出峰時間和基線不穩(wěn)定，檢測時間較長時容易導(dǎo)致基線不穩(wěn)，尤其是在進行梯度洗脫的時候基線波動過大，導(dǎo)致定量困難，而且分析時間長達35 min，因此淘汰此體系。

甲醇和水溶液體系：對甲醇水溶液體系進行梯度洗脫條件和pH值3～6調(diào)整。試驗結(jié)果表明，該體系無法全部分離出5種B族維生素，且出現(xiàn)3個饅頭峰，因此淘汰此體系。

乙腈和水溶液體系：對乙腈水溶液體系進行梯度洗脫條件和pH值3～6調(diào)整。試驗結(jié)果表明，5%乙腈濃度，可以將各個成分分開，VB2和VB12分離時間過長；梯度洗脫條件下，在0 min～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min，5%～30%的梯度洗脫條件下，VB2和 VB12在較短的時間內(nèi)進行了分離，但是VB6的峰形較差；使用乙酸調(diào)整水的 pH 值至 3、4、5 和 6，在 0～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min 5%～30%的梯度洗脫條件下，煙酰胺的峰形很差，出現(xiàn)前拖尾峰。該體系無法用于定量，因此淘汰此體系。

甲醇、乙腈和水溶液體系：對甲醇、乙腈和水溶液體系進行梯度洗脫條件調(diào)整。試驗結(jié)果表明，在0～10 min使用3%乙腈、3%甲醇和水溶液體系進行洗脫，在10 min～20 min使用乙腈3%～30%進行梯度洗脫，試驗結(jié)果表明各個組分均得以分開，峰形對稱。因此選用該體系進行下一步的試驗。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

根據(jù)1.3的色譜條件和1.4的方法進行操作，得出標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖見圖1，色譜圖橫坐標(biāo)為分離時間（min），縱坐標(biāo)為266 nm檢測波長下紫外吸光度（mAu）。由圖1可知，所得5種B族維生素色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)，且樣品中的5種B族維生素和雜質(zhì)的分離度好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

將B族維生素的標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋制成濃度為1.0、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)相應(yīng)的峰面積和對應(yīng)的檢測濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表1），此標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 5～0.999 4。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品（a）和飲料樣品（b）色譜圖Fig.1 Chromatograms of vitamin B standard mixture（a）and drinks（b）

表1 B族維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 The standard curves of B vitamins

2.5 檢測限

將各種B族維生素標(biāo)準(zhǔn)品制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比S/N=3時的質(zhì)量濃度作為檢出限，得到VB1最低檢測濃度為1 μg/mL，VB2最低檢測濃度為 0.1 μg/mL，煙酰胺最低檢測濃度為 1 μg/mL，VB6最低檢測濃度為 1 μg/mL，VB12最低檢測濃度為 0.1 μg/mL。

2.6 精密度和回收率

分別取 1、10 μg/mL 和 20 μg/mL 的各個 B 族維生素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進樣3次，每次進樣5 μL，根據(jù)峰面積計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n=3）Table 2 Results of precision assay（n=3）

由表2可知，各個樣品測定結(jié)果的重現(xiàn)性較好，平均回收率95.75%～102.07%，RSD均小于3%，該色譜分析方法對于B族維生素的分析是準(zhǔn)確、可信。

3 結(jié)論

本文建立一種高效液相色譜-紫外法測定飲料中5種B族維生素的檢測方法，采用直接或者稀釋后0.22 μm濾膜過濾直接上樣，使用Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，采用水、乙腈、甲醇三相梯度洗脫，紫外檢測波長為266 nm。試驗結(jié)果表明，本方法前處理簡單，靈敏度和準(zhǔn)確度高，可以滿足對飲料產(chǎn)品中（煙酰胺），（鹽酸吡哆醇）和5種B族維生素快速檢測要求。

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