固相微萃取分析脯氨酸美拉德反應(yīng)物香氣成分

魏敏，陳義坤，宋旭艷，羅誠浩，潘曦，黃龍

（湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

美拉德反應(yīng)是指含有羰基的化合物和含有氨基的化合物之間經(jīng)縮合、聚合等一系列反應(yīng)而生成多種小分子風(fēng)味物質(zhì)及類黑精的復(fù)雜反應(yīng)，也被稱為棕色化反應(yīng)或褐變反應(yīng)[1]，使得食物可具有多種風(fēng)味和色澤[2-3]。Kam Huey Wong等[4]詳細(xì)地研究了葡萄糖與17種氨基酸在酸性條件下的美拉德反應(yīng)呈味情況，發(fā)現(xiàn)脯氨酸可以產(chǎn)生令人愉悅的花香氣味。馮洪濤等[5]、高徐梅等[6]進(jìn)行了等摩爾比葡萄糖與脯氨酸在丙二醇水體系中的美拉德反應(yīng)，分別采用同時(shí)蒸餾萃取GC/MS和GC/MS分別鑒定出19種、27種揮發(fā)性成分。固相微萃取法是目前復(fù)雜基體中痕量組分分析的主要前處理技術(shù)，其克服了水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法等傳統(tǒng)處理時(shí)樣品需求量大、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，具有操作簡單，選擇性較好等特點(diǎn)[7－8]，目前廣泛應(yīng)用于酒類[9－11]、飲料[12]、茶葉[13]、中草藥[14]、植物[15]、美拉德反應(yīng)物[16]等揮發(fā)性成分分析及鑒定。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）檢測脯氨酸美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性香氣成分，優(yōu)化了固相微萃取條件，探討脯氨酸美拉德反應(yīng)物的高效、快速分析香味物質(zhì)的方法及分析其揮發(fā)性香氣物質(zhì)，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

脯氨酸美拉德反應(yīng)物：由脯氨酸、葡萄糖按摩爾比2∶1，在水溶液中進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備所得。

AHYQ HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；CP 2202S-OCE 天平：Sartorius AG Germany；手動(dòng)SPME進(jìn)樣手柄、手動(dòng)萃取纖維頭 [100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二乙烯基苯）、75 μm CAR（碳分子篩）/PDMS]、15 mL專用頂空萃取樣品瓶：美國Supelco公司；TRACE GC Ultra-DSQⅡ型氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用儀：美國熱電科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPME條件

稱取脯氨酸美拉德反應(yīng)物樣品1 g，置于15 mL專用頂空萃取樣品瓶中，插入已老化的3種不同萃取頭，在一定溫度下預(yù)平衡10 min，萃取一定時(shí)間，采用單因素試驗(yàn)法，通過評估萃取能力大小和萃取物質(zhì)種類的多少，對萃取頭的種類、萃取溫度和萃取時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

萃取頭選擇：選用 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種萃取頭，分別以 250℃30 min、250℃ 30 min、300℃ 30 min條件下老化，插入裝有脯氨酸美拉德反應(yīng)物的15 mL專用頂空萃取樣品瓶，在60℃萃取30 min后比較萃取結(jié)果。

萃取溫度選擇：采用最優(yōu)萃取頭分別在40、50、60、70、80℃溫度下萃取30 min后比較萃取結(jié)果。

萃取時(shí)間優(yōu)化：采用最優(yōu)萃取頭在最優(yōu)萃取溫度下分別萃取 30、40、50、60、70、80 min 后比較萃取結(jié)果。

1.2.2 GC/MS分析條件

1.2.2.1 色譜條件

柱初溫50℃，保持2 min，以8℃/min的速率升溫到180℃，保持1 min，再以18℃/min的速率升溫到280℃，保持 30 min；載氣為氦氣（He，純度 99.99%），恒流模式，流速為1.0 mL/min；分流進(jìn)樣方式，分流比1∶10，無溶劑延遲；進(jìn)樣口溫度250℃。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：EI源；電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；接口溫度：280℃，傳輸線 280℃；掃描范圍：33 m/z～350 m/z。使用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索分析，按峰面積歸一化法計(jì)算化合物相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇

不同材質(zhì)的萃取頭對不同化合物的萃取率不同，因此萃取頭的選擇對揮發(fā)性化合物的分析結(jié)果有重要影響。萃取頭的萃取效果主要受萃取頭涂層極性與表面積的影響。非極性涂層可有效萃取非極性化合物，極性涂層可有效萃取極性化合物。比較分析選用不同萃取頭時(shí)美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取結(jié)果見表1。

表1 3種萃取頭的萃取效果Table 1 Extraction efficiencies of three SPME fibers

結(jié)果顯示，3種萃取頭中，100 μm PDMS萃取頭的萃取量較大，且有效峰較多，其次是65 μm PDMS/DVB和75μm CAR/PDMS。因此選取100 μm PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的選擇

溫度對萃取頭的萃取效果有雙重影響，溫度升高時(shí)，有利于分析物在基質(zhì)中的擴(kuò)散，縮短萃取時(shí)間，但升高溫度也會(huì)使分析物在涂層中的分配系數(shù)降低，導(dǎo)致吸附量減小，影響萃取頭的靈敏度。比較分析不同萃取溫度條件下脯氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析結(jié)果，見表2。

結(jié)果顯示，80℃條件下的萃取峰面積最大，且得到的有效峰最多，說明脯氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)物的揮發(fā)性成分在80℃條件下的萃取效果最佳；溫度較低時(shí)，可能該美拉德反應(yīng)物中揮發(fā)性成分揮發(fā)的速度較慢或不完全揮發(fā)；而溫度更高時(shí)，可能是揮發(fā)性物質(zhì)在萃取頭涂層中吸附量下降所致。因此，試驗(yàn)選擇將80℃作為此次美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性成分的萃取溫度。

表2 萃取溫度的選擇Table 2 Selection of extraction temperature

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

比較分析不同萃取時(shí)間條件下脯氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)物中揮發(fā)性成分的分析結(jié)果，見表3。

結(jié)果顯示，就總峰面積而言，隨著萃取時(shí)間的延長，總峰面積明顯增加，當(dāng)萃取時(shí)間超過60 min后，總峰面積變化不再顯著。從有效峰個(gè)數(shù)上看，萃取時(shí)間超過60 min后，有效峰個(gè)數(shù)變化不大，說明超過一定時(shí)間后萃取時(shí)間的延長對有效峰個(gè)數(shù)的影響不大。綜合以上結(jié)果，選擇60 min作為此次美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性成分萃取試驗(yàn)的萃取時(shí)間。

表3 萃取時(shí)間的選擇Table 3 Selection of extraction time

2.2 脯氨酸美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性成分分析

根據(jù)上述所得的最佳萃取試驗(yàn)條件（100 μm PDMS萃取頭，80℃下萃取60 min），以脯氨酸美拉德反應(yīng)物為研究對象，采用HS-SPME-GC-MS檢測分析，見表4。

表4 脯氨酸美拉德反應(yīng)物HS-SPME-GC/MS分析Table 4 HS-SPME-GC/MS results of the volatile compounds in Proline-Glucose Maillard reaction products

續(xù)表4 脯氨酸美拉德反應(yīng)物HS-SPME-GC/MS分析Continue table 4 HS-SPME-GC/MS results of the volatile compounds in Proline-Glucose Maillard reaction products

從表4可以看出，采用HS-SPME-GC/MS方法從脯氨酸美拉德反應(yīng)物中共鑒定出76種揮發(fā)性成分，按照面積歸一化法來計(jì)算這76種揮發(fā)性成分的相對百分含量為74.42%，包括醛類3種（42.94%），雜環(huán)化合物 15種（6.92%），酯類 15種（9.29%），醇類 14種（5.98%），烴類 13種（3.91%），酮類 7種（2.74%），酸類6種（1.87%），烯類3種（0.77%）。就單一物質(zhì)而言，5-（1-哌啶）-2-呋喃甲醛最高，為 35.38%，其次是5-羥甲基糠醛7.04%、鄰苯二甲酸乙酸異丁酯3.23%、庚酸酐1.83%、（Z）-9-十六碳烯酸甲酯1.66%、十六醇1.39%、3-羥基-a-二氫突厥酮1.02%等。其中5-（1-哌啶）-2-呋喃甲醛是本試驗(yàn)脯氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)物揮發(fā)性成分中相對含量最高的物質(zhì)；5-羥甲基糠醛是由葡萄糖等單糖化合物在高溫等條件下脫水生成的具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的醛類化合物，是美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一[17]，廣泛存在于食品中，對血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠四氯化碳肝損傷模型具有保護(hù)作用[18]，也是2，5-呋喃二甲醛等的轉(zhuǎn)化前體物質(zhì)；辛酸奶酪味，腐敗味，澀味，稀釋后呈水果香氣；檸檬烯是烷烴中閾值較低的一種“活性氣味物質(zhì)”，具有清新的檸檬香和柑橘香[19]；β-廣藿香烯是倍半萜類成分；庚酸丁酯呈草藥和弱的生蘋果似水果香味；2，6，10-三甲基十四烷等支鏈烷烴擁有一定的香氣特征；月桂酸干果味、肉豆蔻酸等飽和脂肪酸，可賦予煙氣一種臘味、脂味和柔和的吸味；月桂酸乙酯具有特有的花果香氣，十六烷醇具有玫瑰香氣；棕櫚酸乙酯有脂肪味，腐敗味，水果味，甜味等。

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC/MS方法分析脯氨酸-葡萄糖的揮發(fā)性成分，對SPME條件包括萃取頭的選擇、萃取溫度時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最佳萃取試驗(yàn)條件（100 μm PDMS萃取頭，80℃下萃取60 min）進(jìn)行了檢測分析，美拉德反應(yīng)物的揮發(fā)性成分出峰時(shí)間集中在10 min～24 min之間，總共鑒定出76種化合物，這些揮發(fā)性成分構(gòu)成了該脯氨酸美拉德反應(yīng)物的特殊風(fēng)味，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，對美拉德反應(yīng)物高效、快速分析香味物質(zhì)提供一定參考。

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