響應(yīng)面法優(yōu)化白茅根總黃酮超聲輔助提取工藝

李西騰，張佳佳，尹嵐，鄭楠

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，江蘇淮安223003）

白茅根為禾本科多年生草本植物白茅的根莖[1]，白茅根中含有三萜類化合物、苯丙素類化合物、有機(jī)酸類化合物、糖類、甾醇類、色原酮、黃酮類、內(nèi)酯類，以及鐵、銅、鋅等礦物質(zhì)，主要有止血、免疫調(diào)節(jié)、利尿降壓、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低羥自由基、抗氧化、改善腎功能等作用[2-7]。其中黃酮類化合物具有清除人體內(nèi)自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等功效[8-10]。優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，對其藥用開發(fā)與利用具有重要意義。目前，關(guān)于白茅根活性成分提取工藝的研究主要集中在多糖[11-13]、綠原酸[14-15]、總酚酸[16-18]、三萜類化合物等成分[18]，尚無利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取白茅根總黃酮的工藝條件的研究報(bào)道。本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率、提取時(shí)間等因素進(jìn)行白茅根總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)，以響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，為其開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根：淮安市藥材市場；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YB-2500A型高速多功能粉碎機(jī)：浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SCIEENT型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：日本島津公司；SHZ-DCⅢ循環(huán)水式真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TU-1950紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白茅根總黃酮提取

將白茅根于60℃烘干后粉碎過60目篩。稱取樣品1.0 g，加入乙醇溶液，置于超聲波清洗機(jī)中提取，抽濾，濾液稀釋后搖勻，作為待測液。

1.2.2 白茅根總黃酮測定方法

采取硝酸鋁顯色法[19-20]測定總黃酮含量。在510 nm波長處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

y=7.744 6x+0.005 6，R2=0.999 2。根據(jù)回歸方程，計(jì)算被測樣液中總黃酮的含量。

式中：c為樣品的吸光度代入回歸方程計(jì)算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液定容量，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以白茅根總黃酮提取量為指標(biāo)，對影響白茅根總黃酮提取的各單因素進(jìn)行研究。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定反應(yīng)條件液料比25∶1（mL/g），超聲功率400 W，超聲處理30 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對白茅根總黃酮提取量的影響。

液料比：固定反應(yīng)條件乙醇50%，超聲功率400W，超聲處理30 min，考察不同液料比對白茅根總黃酮提取量的影響。

超聲功率：固定反應(yīng)條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲處理30 min，考察不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響。

時(shí)間：固定反應(yīng)條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲功率400 W，考察不同處理時(shí)間對白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率和時(shí)間4個(gè)因素，黃酮提取量為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化最佳提取工藝條件，具體設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對白茅根總黃酮提取量的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大時(shí)，白茅根總黃酮提取量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取到的總黃酮量較大，因此這里選擇50%的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響

不同液料比對白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖2可知，當(dāng)液料比逐漸增加時(shí)，提取到的白茅根總黃酮的量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，液料比25∶1（mL/g）時(shí)最多。由于增加液料比會稀釋溶液，使得黏度得以降低，這對超聲波的空化非常有利，因此能夠增加提取量，然而，若料液比進(jìn)一步增加，溶液體積增加將會導(dǎo)致機(jī)械效應(yīng)以及空化作用減弱。所以，這里選擇液料比 25 ∶1（mL/g）。

2.1.3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響

不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖3可知，當(dāng)超聲功率逐漸升高時(shí)，提取到的白茅根總黃酮的量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當(dāng)超聲功率為500 W時(shí)，提取到的總黃酮的量較大，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮的提取量下降。因此，選擇超聲功率為500 W。

2.1.4 提取時(shí)間對白茅根總黃酮提取量的影響

不同提取時(shí)間對白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖4可知，總黃酮的提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增加，超過30 min降低。因此，選擇30 min為適宜的超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到白茅根中總黃酮提取量（Y）對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=2.18-0.012A-0.056B+0.10C-0.058D-0.056AB-0.11AC+0.022AD-0.068BC-0.024BD-0.029CD-0.13A2-0.20B2-0.23C2-0.15D2。

2.2.2 回歸方程方差分析

方差分析結(jié)果見表3。

從表3可以看出模型Prob>F值小于0.000 1，表明該回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.982 3，說明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取試驗(yàn)的理論預(yù)測。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients and their significance test

2.2.3 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化

響應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對白茅根總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

除了乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比、超聲功率和提取時(shí)間對黃酮提取量的影響顯著。兩兩因素之間對響應(yīng)值均有一定的交互作用，其中AB、AC、BC之間的交互作用比較明顯。由圖5可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ投寄苓_(dá)到極值點(diǎn)，利用軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白茅根總黃酮的最佳提取工藝如下：乙醇體積分?jǐn)?shù) 48.50%、液料比 24.22∶1（mL/g）、超聲功率529.47 W、提取時(shí)間28.93 min，此時(shí)的預(yù)測值為2.21 mg/g。為方便實(shí)際操作，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比 25∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時(shí)間30 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果為2.18 mg/g，將試驗(yàn)值與預(yù)測值相近，說明該回歸模型與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論

通過Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化并得到了提取白茅根總黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比 25 ∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時(shí)間 30 min，實(shí)際提取到的白茅根總黃酮為2.18 mg/g，與理論預(yù)測值2.21 mg/g相近。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝具有可行性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲輔助可以提高總黃酮的提取效率，還需要進(jìn)一步探討超聲對其生物活性影響的相關(guān)性，以及白茅根總黃酮的抗氧化活性。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:99

[2]劉金榮.白茅根的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用[J].山東中醫(yī)雜志,2014,33(12):1021-1024

[3]劉榮華,付麗娜,陳蘭英,等.白茅根化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010(4):80-83

[4]李昌靈,張建華.白茅根提取物的抑菌效果研究[J].懷化學(xué)院學(xué)報(bào),2012,31(11):34-37

[5]包永睿,王帥,孟憲生,等.白茅根水提物對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2013,24(7):1584-1586

[6]李立順,時(shí)維靜,王甫成.白茅根化學(xué)成分、藥理作用及在保健品開發(fā)中的應(yīng)用[J].安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2011,25(2):61-64

[7]劉軒,張彬鋒,侴桂新,等.白茅根的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志,2012,37(15):2296-2300

[8]楊文斌,羅惠波,葉光斌,等.溪黃草中黃酮類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2016,37(16):47-51

[9]P MladeěNka,L Zatloukalová,T Filipsky,et al.Cardiovascular effects of flavonoids are not caused only by direct antioxidant activity[J].Free Radical Biology and Medicine,2010,49(6):963-975

[10]Mustafa R A,Abdul Hamid A,Mohamed S,et al.Total phenolic compounds,flavonoids,and radical scavenging activity of 21 selected tropical plants[J].Journal of Food Science,2010,75(1):C28-C35

[11]李粉玲,蔡漢權(quán),邱永革,等.白茅根多糖的微波提取工藝研究[J].食品與機(jī)械,2009,25(2):137-140

[12]王海俠,吳云,時(shí)維靜,等.白茅根多糖的提取與含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(2):55-57

[13]李容,梁榕珊,覃濤,等.白茅根多糖抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究[J].食品研究與開發(fā),2014,35(7):9-12

[14]王瑩,孟憲生,包永睿,等.白茅根水提物中綠原酸的含量測定[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(3):22-24

[15]王海俠,姚青春,時(shí)維靜,等.白茅根中綠原酸提取與含量測定[J].中國中醫(yī)藥科技,2010,17(4):331-332

[16]熊科元,陳石生,劉榮華,等.白茅根中兩種主要酚酸成分的含量比較[J].中國醫(yī)藥指南,2010,10(2):72-73

[17]熊科元,劉榮華,陳石生,等.不同產(chǎn)地白茅根總酚酸的含量比較[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2012,23(4):844-845

[18]李容,盧小雪,張德威,等.綜合評分優(yōu)選白茅根總酚酸和總?cè)铺崛」に嘯J].食品研究與開發(fā),2013,34(24):77-80

[19]黎望,孫培冬,季曉彤,等.黃蜀葵花黃酮抗氧化性及對DNA氧化損傷的保護(hù)作用[J].食品與機(jī)械,2017,33(2):135-139

[20]于金躍,孫晶,李新華,等.響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2015,36(6):295-303