水熱法提取金銀花中綠原酸的工藝研究

李杰，陳道鴿，王兵兵，王學(xué)廷

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023）

綠原酸（Chlorogenic Acid，CA）是一種縮酚酸，在植物中經(jīng)莽草酸途徑形成的一類苯丙素類化合物[1]，是國(guó)際公認(rèn)的“植物黃金”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠原酸具有多種藥理活性[3]，如抗腫瘤、降血壓、抗病毒等。同時(shí)，綠原酸還作為食品添加劑和植物生長(zhǎng)激素，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)[4-5]。鑒于綠原酸具有多種藥理活性和廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，因此如何有效的從植物中進(jìn)行提取越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前國(guó)外主要從咖啡豆中[6]提取綠原酸，而國(guó)內(nèi)多以金銀花為原料進(jìn)行提取。金銀花原產(chǎn)我國(guó)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，并且作為經(jīng)濟(jì)作物在各省都有大規(guī)模的人工種植區(qū)，資源豐富。

目前金銀花中綠原酸的提取按照提取溶劑分類可大致分為水提法、有機(jī)溶劑提取法[7-8]和二氧化碳超臨界萃取法[9]。從經(jīng)濟(jì)方面考慮水提法較為理想、實(shí)際，但是傳統(tǒng)的水提法都是在開放的體系中進(jìn)行提取，存在提取時(shí)間長(zhǎng)、得率低等問(wèn)題。近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的亞臨界水提取[10]技術(shù)在一定程度上克服了傳統(tǒng)水提法的不足，但設(shè)備比較昂貴，主要由高壓注射泵、恒溫爐、預(yù)加熱器、萃取罐、冷卻器及萃取接受等裝置組成[11]，提取成本較高。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效的水提法來(lái)提取金銀花中的綠原酸。

水熱法[12]是納米材料合成[13-14]的一種常用方法，但在中藥活性組分提取方面的應(yīng)用研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。其原理主要是以水為反應(yīng)介質(zhì)，通過(guò)對(duì)密閉的反應(yīng)體系加熱，在體系內(nèi)部創(chuàng)造一個(gè)高溫、高壓的反應(yīng)環(huán)境，使水處于亞臨界（溫度介于100℃～374℃之間）或超臨界（溫度高于374℃）[15]狀態(tài)，從而表現(xiàn)出高活性、高傳質(zhì)速率的特點(diǎn)。該方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)探討了液料比、提取溫度以及提取時(shí)間對(duì)金銀花中綠原酸得率的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以綠原酸的得率為響應(yīng)值，對(duì)該提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為綠原酸的提取提供一種新途徑、新方法，同時(shí)為金銀花的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

金銀花：洛陽(yáng)中藥材批發(fā)市場(chǎng)（粉碎過(guò)80目篩），經(jīng)河南科技大學(xué)王學(xué)廷副教授鑒定，均為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）：上海金穗生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸（均為色譜純）：天津市巴斯夫化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

天美LC2000液相色譜儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；CT14RD高速離心機(jī)：上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；BT125D雙量程電子分析天平：德國(guó)多利斯公司；聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜：福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所；PHG9246A烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 綠原酸的測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸（13∶87，體積比）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，50%甲醇溶液溶解，并定容于50 mL棕色容量瓶中，逐級(jí)稀釋為5、10、20、30、40、50 μg/mL 的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“2.1.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定綠原酸的峰面積，以各濃度為縱坐標(biāo)（Y），峰面積為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程。

2.1.3 供試品溶液的制備及測(cè)定

按照料液比稱取金銀花粉末于18 mL水混合于水熱釜中，密封反應(yīng)釜并置于一定溫度的烘箱內(nèi)進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，自然冷卻至室溫，移取提取液2.00 mL以10 000 r/min離心分離5 min，取上清液0.20 mL于10 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，50%甲醇定容，0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試液，高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 法測(cè)定綠原酸的含量。

根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中綠原酸的濃度，按公式計(jì)算綠原酸得率。改變提取條件，考察液料比、提取溫度以及提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響。

式中：C為提取液中綠原酸的濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為金銀花質(zhì)量，g。

2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）5 個(gè)水平；提取溫度 80、90、100、110、120、130℃ 6個(gè)水平以及提取時(shí)間 10、20、30、40、50 min 5 個(gè)水平分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素影響的試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)Design Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法安排試驗(yàn)，優(yōu)選水熱法提取的最佳工藝參數(shù)。采用三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，水平編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken效應(yīng)面法因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface method

2.4 數(shù)據(jù)分析

金銀花中綠原酸提取試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取平均值，然后利用Origin8.0和Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的色譜圖

圖1是綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、供試品以及空白溶劑的高效液相色譜圖。

從圖1中可以看出，在“2.1.1”的色譜條件下，供試液中的綠原酸和雜峰在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好分離，且峰形對(duì)稱不拖尾。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度Y與峰面積 X 的回歸方程為：Y=2×10-5X+0.314 2，R2=0.999 9，線性關(guān)系良好。

圖1 供試品溶液（A）綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（B）空白溶劑（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of reference sample（A），reference substance（B）and 50%methanol（C）

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 精密度試驗(yàn)

取同一個(gè)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸的峰面計(jì)，綠原酸的RSD為1.42%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取金銀花粉末 0.8 g，液料比為 20 ∶1（mL/g），提取溫度90℃，提取時(shí)間30 min，平行提取6份，在“2.1.1”色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，綠原酸峰面積的RSD值為1.39%，說(shuō)明水熱法提取綠原酸的重復(fù)性和穩(wěn)定較好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試液樣品，在上述的色譜條件下，分別于配置后0、2、4、6、24 h進(jìn)樣，記錄綠原酸的峰面積，RSD值為0.60%，表明供試液液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.4 回收率試驗(yàn)

精密量取0.5mL已知含量（綠原酸含量為0.545mg）供試液于50 mL容量瓶中，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液（2.18 mg/mL）0.4、0.5、0.6 mL，按照低、中、高制備3組，平行測(cè)定3次，測(cè)得綠原酸平均加樣回收率為96.58%，RSD=1.89%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1 液料比對(duì)綠原酸得率的影響

在提取溫度為110℃，提取時(shí)間為20 min，液料比為 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）進(jìn)行試驗(yàn)，探討液料比綠原酸得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知隨著液料比增大，綠原酸得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著提取溶劑體積的增大，金銀花粉末與水的接觸面積增大，使得綠原酸的得率逐漸升高，當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，綠原酸得率最大。超過(guò)30∶1（mL/g）后，綠原酸得率逐漸降低，這可能是由于當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）g時(shí)，在此提取條件下，金銀花中的綠原酸已經(jīng)完全提取出來(lái)，如果繼續(xù)擴(kuò)大液料比只會(huì)稀釋提取液中綠原酸的濃度，從而表現(xiàn)為綠原酸的得率降低。因此，選擇液料比為30∶1（mL/g）較為合適。

圖2 液料比對(duì)綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on CA extraction yield

3.3.2 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響

選擇試驗(yàn)條件為液料比30∶1（mL/g），提取時(shí)間20 min，提取溫度控制為 80、90、100、110、120、130 ℃，討論提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on CA extraction yield

從圖3中可以看出在80℃～110℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，綠原酸的得率也逐步提高。當(dāng)提取溫度為110℃時(shí)，綠原酸得率最高。一方面是由于溫度的升高，加快了分子的擴(kuò)散速度，使溶劑和固體組織充分接觸，促進(jìn)了整個(gè)提取過(guò)程的質(zhì)量轉(zhuǎn)移。此外提取溫度超過(guò)100℃，水處于亞臨近狀態(tài)，與普通水相比，水的介電常數(shù)、表面張力和黏度都顯著降低，水分子之間的氫鍵減弱，極性減小[16]，提高了綠原酸在水中的溶解性和傳質(zhì)系數(shù)。同時(shí)，溫度的升高也致使提取體系內(nèi)的飽和蒸汽壓升高，壓力的升高有助于提高水對(duì)基質(zhì)的穿透能力，縮短溶劑在基質(zhì)的提取速度[17]，從而提高綠原酸的溶出速度。當(dāng)提取溫度超過(guò)110℃時(shí)，綠原酸的得率開始降低，這可能是由于較高的溫度和壓力導(dǎo)致綠原酸分解所致。

3.3.3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率得影響

固定液料比 30 ∶1（mL/g），提取溫度為 110 ℃，選取 10、20、30、40、50 min 進(jìn)行試驗(yàn)，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率得影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on CA extraction yield

由圖4可知，水熱法提取10 min～30 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中綠原酸的含量不斷增加，超過(guò)30 min時(shí)，綠原酸的含量趨于平穩(wěn)。這是由于在提取的初期，金銀花中的綠原酸未被完全溶解出來(lái)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸逐漸被全部溶解出來(lái)并擴(kuò)散到提取溶劑中，直至達(dá)到平衡。因此，提取時(shí)間宜控制在30 min左右。

3.4 Box-Behnken法試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金銀花中綠原酸得率得響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過(guò)二次回歸擬合，得出擬合方程為：

Y=3.24-0.044A+0.13B-0.049C-0.11AB+0.13AC+0.045BC+0.038A2-0.060B2+0.053C2。

響應(yīng)面分析法對(duì)綠原酸得率得ANOVA分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析法對(duì)綠原酸得率得ANOVA分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

表3對(duì)回歸方程進(jìn)行了方差分析，從中可以看出，各個(gè)因素對(duì)金銀花中綠原酸得率影響的主次順序?yàn)锽>C>A，即提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。3個(gè)因素對(duì)綠原酸得率影響顯著程度排序?yàn)椋篈C>AB>BC。P值的大小表明模型及各考察因素的顯著水平。P值小于0.05，表明模型或各因素有顯著影響；P值小于0.01表明模型或各因素高度顯著[18]。由表3可知，以綠原酸得率為響應(yīng)值時(shí)，模型P=0.000 8＜0.010 0，表明該二次方程模型高度顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.598 4＞0.100 0，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合良好，可利用該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.981 4，與校正系數(shù)Adj.R2=0.947 9相近，表明綠原酸得率得預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值有較好的擬合度。變異系數(shù)（CV）為1.09%，也說(shuō)明模型的置信度較高，模型方程能夠很好的反映真實(shí)試驗(yàn)值，利用該回歸方程可以確定水熱法提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件。

以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量的曲面和等高線圖，見(jiàn)圖5。

等高線圖表示提取時(shí)間、提取溫度、液料比這3個(gè)因素中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)綠原酸提取率的影響。從圖中可以看出提取溫度對(duì)綠原酸提取率影響最顯著，表現(xiàn)為曲線比較陡峭，提取時(shí)間和液料比次之，表現(xiàn)為曲線較平滑。應(yīng)用Design Expert 8.0.5軟件求導(dǎo)，可得水熱法的最佳提取條件為：提取時(shí)間20 min，提取溫度為120℃，液料比為20∶1（mL/g），在此條件條件下，綠原酸得率的預(yù)測(cè)值為3.69%。

圖5 提取溫度、提取時(shí)間和液料比交互作用對(duì)綠原酸得率的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between extraction temperature,extraction time and liquid-solid ratio on yield of CA

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最佳提取條件，平行提取3份，將結(jié)果與二項(xiàng)式擬合方程的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較。計(jì)算偏差：偏差=（預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值）/預(yù)測(cè)值×100%，結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification test

從表中可以看出，優(yōu)選的水熱法提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的偏差較小，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的綠原酸水熱法提取工藝條件可信。同時(shí)將水熱法與《中國(guó)藥典》中采用的超聲波法進(jìn)行了對(duì)比，超聲法的得率分別為3.29%、3.21%和3.24%，平均得率為3.25%，水熱法得率明顯高于超聲法，且所用的溶劑價(jià)廉、安全環(huán)保。

4 結(jié)論

本研究將水熱法應(yīng)用于綠原酸的提取，是一種新的探索。相對(duì)于有機(jī)溶劑提取，水是一種綠色環(huán)保而又價(jià)廉的提取溶劑，通過(guò)調(diào)控提取溫度使水處于亞臨界狀態(tài)，有效的降低了水的極性和黏度，促進(jìn)了目標(biāo)物的溶出速度，提高了提取效率。同時(shí)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)水熱法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)探討液料比、提取溫度以及提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響，發(fā)現(xiàn)提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響最大，其次是液料比，提取時(shí)間影響最小。水熱法提取綠原酸的最佳工藝參數(shù)為：提取時(shí)間20 min，提取溫度120℃，液料比20∶1（mL/g），在此條件下，綠原酸的得率為3.60%與預(yù)測(cè)值3.69%基本相符，表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的水熱法提取工藝具有良好的可行性。與超聲提取工藝相比，水熱法具有省時(shí)、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。該提取方法的建立為綠原酸的提取以及金銀花的開發(fā)、利用提供了參考，同時(shí)為植物中活性物質(zhì)的提取提出了一種新方法。

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