響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨總黃酮提取工藝

劉英，張麗艷，*，羅君，謝宇

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州貴陽550001；3.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州貴陽550014）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科植物，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[1]，其果實(shí)具有消食健脾、收斂止瀉的功效，主治積食腹脹、泄瀉，也為貴州省苗族習(xí)用藥材[2]。刺梨主要分布于貴州、四川、湖北、云南等省，其含有豐富的黃酮類、維生素C等[3]。黃酮類化合物是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，具有抗衰老、抗菌、抗炎等功效[4]。刺梨可藥食兩用，目前在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，其需求量呈逐年上升趨勢[3]。刺梨總黃酮提取工藝的研究雖有報(bào)道[5-6]，但主要采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面法是一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)學(xué)建模相結(jié)合的優(yōu)化方法[7]，克服了正交試驗(yàn)只對孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析的缺點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于食品藥品有效成分的工藝研究[8-9]?；诖?，本研究利用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨總黃酮的提取工藝，以期為提高刺梨的綜合利用率，降低生產(chǎn)成本，改進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：采集于貴州省龍里縣谷腳鎮(zhèn)茶香村，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghii Tratt.的果實(shí)。鮮果去掉種子、萼片，粉碎過四號篩，密封備用。

蘆丁對照品（批號：10080-200707）：中國藥品生物制品檢定所；乙醇：重慶川東化工有限公司；氫氧化鈉：廣東汕頭市西隴化工廠；硝酸鋁：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉：重慶江川化工有限公司；以上試劑均為分析純；水：蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

UV-2501PC型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多公司；電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；GZX-GF101-4-S-II型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加65%乙醇溶液制成每1 mL含蘆丁0.5 mg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

取刺梨粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇溶液35 mL，密塞，稱定重量，于70℃回流提取115.5 min，放冷，再稱定重量，用65%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 檢測波長的確定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液適量，分別置10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，加65%乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min。以試劑空白作參比，在200nm～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在499 nm波長處有一最大吸收峰，故選取499 nm為檢測波長。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置10 mL量瓶中，照“1.3.3”項(xiàng)下方法，于499 nm波長測定吸光度。

1.3.5 樣品中總黃酮的含量測定

精密量取樣品溶液適量，置10 mL量瓶中，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法，于499 nm波長測定吸光度，根據(jù)回歸方程求出濃度，再根據(jù)式1計(jì)算總黃酮提取率：

式中：C為提取總黃酮的濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗(yàn)考察

1.3.6.1 提取方法

取刺梨粉末（曬干）約0.5 g，精密稱定，固定提取溶劑 75%乙醇，料液比 1∶80（g/mL），提取時(shí)間 60 min，提取溫度70℃，考察不同提取方法（回流法、超聲法、冷浸法）對總黃酮提取率的影響。

1.3.6.2 溶劑濃度

取刺梨粉末（曬干）約0.5 g，精密稱定，固定提取方法回流法，料液比1∶80（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取溫度70℃，考察不同濃度乙醇（45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%）對總黃酮提取率的影響。

1.3.6.3 提取時(shí)間

取刺梨粉末（曬干）約0.5 g，精密稱定，固定提取方法回流法，提取溶劑提取溶劑65%乙醇，料液比1∶80（g/mL），提取溫度 70℃，考察不同提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）對總黃酮提取率的影響。

1.3.6.4 料液比

取刺梨粉末（曬干）約0.5 g，精密稱定，固定提取方法回流法，提取溶劑提取溶劑65%乙醇，提取時(shí)間120 min，提取溫度70℃，考察不同料液比[1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）]對總黃酮提取率的影響。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平，選取溶劑濃度（A），料液比（B），提取時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取率（%）為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面法試驗(yàn)，共17個試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個析因試驗(yàn)，5個中心試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 因素水平編碼Table 1 Coded of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：A=11.847C+0.0314（r=0.999 6），結(jié)果表明蘆丁在0.01 mg/mL～0.06 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取方法對總黃酮提取率的影響

提取方法對總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 提取方法對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction methods on extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，回流提取的總黃酮提取率較高，故選擇回流法為提取方法。

2.2.2 溶劑濃度對總黃酮提取率的影響

溶劑濃度對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 溶劑濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of dissolvant concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，刺梨總黃酮提取率呈先升后降的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，總黃酮提取率較高。原因可能為刺梨中等極性的黃酮類物質(zhì)含量較高，當(dāng)乙醇濃度大于65%時(shí)，溶劑的極性降低，導(dǎo)致某些黃酮類物質(zhì)的溶解度下降，而脂溶性物質(zhì)溶出量增大，故選擇65%乙醇為提取溶劑。

2.2.3 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間小于120 min時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率逐漸增大，120 min后，總黃酮提取率呈下降趨勢，原因可能為隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞或其穩(wěn)定性變差，故選擇120 min為提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，隨溶劑體積的增加，總黃酮提取率逐漸增大，料液比達(dá)1∶70（g/mL）后，總黃酮提取率呈下降趨勢，原因可能為隨著溶劑體積的增大，一些非黃酮類可溶性物質(zhì)的溶解度也逐漸增大，導(dǎo)致總黃酮提取率降低，故選擇1∶70（g/mL）為料液比。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experiment design and result of response surface method analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Continue table 2 Experiment design and result of response surface method analysis

2.3.2 模型的建立及其有效性檢驗(yàn)

為了明確各因素對總黃酮提取率的影響，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率與各試驗(yàn)因素的多元二次回歸方程模型Y=10.68+0.010A-0.13B+0.22C-0.16AB-0.17AC-0.099BC-0.79A2-0.49B2-0.85C2，方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小反映了各因素對指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。為了檢驗(yàn)該模型的有效性，對該二次模型及其回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

由表3可知，該模型P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的；該模型的失擬項(xiàng)P=0.446 0＞0.05，且該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.986 4，說明總黃酮提取率的變化有98.64%來源于試驗(yàn)因素，1.36%的數(shù)據(jù)失擬可能由隨機(jī)誤差引起，該模型與實(shí)際情況擬合較好，失擬項(xiàng)不顯著，可用于預(yù)測刺梨總黃酮提取率并對刺梨中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在本試驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，提取時(shí)間的線性效應(yīng)、溶劑濃度和提取時(shí)間的交互作用、溶劑濃度和料液比的交互作用對刺梨總黃酮提取率有顯著影響；料液比的線性效應(yīng)、溶劑濃度的曲面效應(yīng)、提取時(shí)間的曲面效應(yīng)、料液比的曲面效應(yīng)對刺梨總黃酮提取率有極顯著影響；表明各因素對總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。因素系數(shù)的F值越大則表明該因素對響應(yīng)值的影響越大，故影響總黃酮提取率的因素主次順序?yàn)椋篊>B>A，即料液比＞提取時(shí)間＞溶劑濃度。

根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面圖和等高線圖，通過響應(yīng)曲面圖的陡峭程度及等高線圖形狀可分析當(dāng)溶劑濃度，提取時(shí)間，料液比其中一個因素固定時(shí)，另外兩個因素對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 溶劑濃度與提取時(shí)間對總黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface polt and contour for the effects of dissolvant concentration and extraction time on extraction yield of total flavonoids

從響應(yīng)曲面的陡峭程度可以看出，料液比和提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，溶劑濃度對總黃酮提取率的影響較小，表現(xiàn)為曲線較平滑，這與方差分析所得的結(jié)論一致。

等高線的形狀可以反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。由各因素交互作用的等高線可知溶劑濃度與料液比的交互作用較顯著，溶劑濃度與提取時(shí)間交互作用次之，料液比和提取時(shí)間的交互作用較小，這與方差分析結(jié)果相符。

圖6 溶劑濃度與料液比對總黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface polt and contour for the effects of dissolvant concentration and material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

本試驗(yàn)以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到總黃酮的最佳提取條件為：溶劑濃度為65.06%，提取時(shí)間為115.49 min，料液比為1∶71.37（g/mL）。此條件下，總黃酮提取率的理論預(yù)測值為10.71%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化所得的提取工藝進(jìn)行提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：65%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為 115.5 min，料液比為 1∶71（g/mL），在此條件下進(jìn)行6組重復(fù)試驗(yàn)，所得總黃酮平均提取率為10.76%，與理論預(yù)測值的相對偏差為0.32%，說明此模型準(zhǔn)確可靠，可用于預(yù)測不同提取條件下總黃酮的提取率。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)分別考察了提取方法、溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比對刺梨中總黃酮提取率的影響，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果選取溶劑濃度，提取時(shí)間，料液比為考察因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面法試驗(yàn)，最終得到的刺梨提取工藝為：65%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為 115.5 min，料液比為 1∶71（g/mL），在此條件下總黃酮的提取率為10.76%。響應(yīng)面法優(yōu)化所得的總黃酮提取工藝準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

圖7 提取時(shí)間與料液比對總黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface polt and contour for the effects of extraction time and material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

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