小麥種子成熟過程中果皮衰亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究

劉大同， 陳 明， 江 偉， 李 曼， 張 曉， 高德榮，

（1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所／農(nóng)業(yè)部長江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州225007；2.揚(yáng)州大學(xué)／江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 揚(yáng)州225009）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上最重要的糧食作物之一。小麥的種子是穎果，果皮由子房壁發(fā)育而來，包裹在穎果外層，由外果皮、中果皮、內(nèi)果皮三部分共同組成［1］。果皮不僅可以保護(hù)胚和胚乳，而且是營養(yǎng)物質(zhì)的中間轉(zhuǎn)運(yùn)及暫時(shí)積累的場所［2］。前人研究表明，小麥果皮在穎果生長發(fā)育過程中會發(fā)生細(xì)胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD），果皮中的淀粉也會發(fā)生不同程度的降解［3－5］。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，從小麥開花到花后11d，在葉綠體和淀粉體中會有果皮淀粉積累，花后11d淀粉粒逐漸降解［1］。

小麥果皮中含有多種有益礦質(zhì)元素，其含量低于糊粉層但高于胚乳，有較高的營養(yǎng)價(jià)值［6－8］。同時(shí)小麥果皮厚度也與出粉率有一定關(guān)系［9－11］。在面粉加工過程中，為提升小麥制品的口感，會將麩皮和胚芽去除。隨著皮層的部分去除，小麥表面的微生物群和農(nóng)藥、重金屬殘留明顯降低，有效保證了面粉的安全和質(zhì)量［12］，但也損失了絕大部分纖維素和一半以上的維生素、煙酸及礦物質(zhì)等對人體有益的營養(yǎng)成分［5］。如何在保證安全的前提下盡可能保留果皮中的有益成分值得關(guān)注和研究。

揚(yáng)麥16是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所培育的優(yōu)質(zhì)原料小麥品種，具有灌漿快、出粉率高的特點(diǎn)，出粉率比一般原料小麥高2個百分點(diǎn)，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場優(yōu)勢［13－14］。目前關(guān)于揚(yáng)麥16出粉率高的原因尚未明確，其果皮發(fā)育這一關(guān)鍵因素未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)利用樹脂切片方法，研究揚(yáng)麥16穎果灌漿充實(shí)和發(fā)育成熟過程中果皮發(fā)育的狀況，并重點(diǎn)分析了果皮的細(xì)胞形態(tài)變化，擬為揭示揚(yáng)麥16及同類型品種出粉率高的機(jī)理和遺傳改良等提供理論依據(jù)和形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2014—2017年在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所灣頭試驗(yàn)基地（32°39′N，119°42′E，亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫14.8～15.3℃，年平均降水量961～1 048mm）進(jìn)行。以長江中下游麥區(qū)生產(chǎn)上占有主體面積的揚(yáng)麥16為材料，生長期常規(guī)化管理，及時(shí)防控病蟲害。為獲取不同發(fā)育天數(shù)的穎果，在開花期采用記號筆點(diǎn)穎與植株掛牌相結(jié)合的方法正確標(biāo)記開花日期，標(biāo)記的穎花均為穗中部小穗基部的2朵花。從花后5d開始取樣，直到種子成熟。

1.2 方 法

1.2.1 穎果的光學(xué)顯微鏡觀察

利用樹脂半薄切片法觀察穎果的顯微結(jié)構(gòu)。將小麥穎果從中部橫切，取2mm厚的切段，置于2.5%戊二醛（25%戊二醛溶于pH＝7.2磷酸緩沖液稀釋）中固定（4℃）4h。固定好的樣品經(jīng)pH＝7.2磷酸緩沖液清洗（共3次，每次10min）、梯度乙醇（20%，40%，60%，70%，80%，90%，95%和100%，3 次 重 復(fù)，每 次10min）脫水，環(huán)氧丙烷置換，Spurr低粘度樹脂浸透與包埋（70℃聚合10h）。聚合好的樣品塊先用玻璃刀在超薄切片機(jī)（Ultracut R，Leica，Germany）上切1μm厚半薄切片，經(jīng)1%番紅和甲基紫重復(fù)染色10min后，在光學(xué)顯微鏡（DMLS，Leica，Germany）下觀察并拍照。

1.2.2 分析作圖

圖版的制作采用Photoshop圖像處理軟件（Version CS 6，Adobe，USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥穎果橫切面的解剖結(jié)構(gòu)

由小麥穎果橫切面顯微結(jié)構(gòu)可見，花后5d的穎果，由一層厚厚的果皮包被著胚乳，果皮厚度占穎果橫徑的近一半。在正對背部維管束的腹部果皮頂部有明顯的凹陷，并且有一個因淀粉體積累而形成的被染成深色的條帶（圖1A）。隨著灌漿物質(zhì)的積累，穎果逐漸發(fā)育成熟?；ê?5d的穎果橫切面顯示，腹部果皮頂部的凹陷充實(shí)膨脹，穎果由倒心形充實(shí)為接近圓形；淀粉體條帶消失不見（圖1B）。與花后5d相比，胚乳所占比例大大增加，外面僅有很薄的果皮包被，果皮厚度和細(xì)胞層數(shù)明顯減小。

圖1 小麥果皮厚度隨穎果發(fā)育天數(shù)的變化

2.2 種子成熟過程中果皮的細(xì)胞形態(tài)變化

對發(fā)育穎果腹部頂端的果皮進(jìn)行1 000倍放大觀察，由穎果發(fā)育早期（花后5～15d）的顯微結(jié)構(gòu)可見（圖2A～F），果皮可根據(jù)細(xì)胞大致形態(tài)分為3部分：1）外果皮，位于最外層，由1～2層排列緊密的細(xì)胞組成；2）中果皮，由細(xì)胞形狀較一致的多層多邊形薄壁細(xì)胞組成；3）內(nèi)果皮，靠近胚乳部分，由靠外側(cè)體積較大的橫細(xì)胞和1層排列規(guī)則的管細(xì)胞組成。花后5d顯微結(jié)構(gòu)顯示，果皮的3種結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞排列規(guī)則，內(nèi)含物豐富，此時(shí)果皮已發(fā)育完善。隨著穎果發(fā)育成熟，整個果皮的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)都發(fā)生了明顯變化，呈現(xiàn)退化衰亡的趨勢。具體表現(xiàn)為：

外果皮隨著穎果發(fā)育，細(xì)胞橫向上略有伸長，細(xì)胞核和淀粉粒等細(xì)胞內(nèi)含物逐漸消失。細(xì)胞從較規(guī)則的方形或矩形（圖2A、C、E）變成橢圓形（圖2G），在花后25d由于進(jìn)一步擠壓變成不規(guī)則的橫向矩形或橢圓形（圖2I）。細(xì)胞壁逐漸加厚，并且在花后20d和25d達(dá)到最厚，加厚的細(xì)胞壁可能有利于增加對穎果的保護(hù)作用；相鄰2層細(xì)胞壁間的空隙明顯增大，形成了較大的質(zhì)外體空間。

中果皮在穎果發(fā)育早期是果皮的主要組成部分?；ê?d，細(xì)胞中的淀粉體由于受到大液泡擠壓而沿著細(xì)胞壁分布；越靠近內(nèi)果皮，細(xì)胞中淀粉體數(shù)量越多（圖2A、B）。該時(shí)期中果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)含物豐富，淀粉體發(fā)育較好，處于正常生理功能時(shí)期。花后10d，細(xì)胞中淀粉體數(shù)量和體積均增大，淀粉體多為復(fù)粒淀粉（圖2C、D）；部分細(xì)胞開始發(fā)生解體，內(nèi)部的淀粉體游離到細(xì)胞外（圖2D）?；ê?5d，中果皮進(jìn)一步受到擠壓發(fā)生解體；靠近外果皮的細(xì)胞中，由同一核點(diǎn)發(fā)生的多個復(fù)粒淀粉粒發(fā)生分離；靠近內(nèi)果皮的細(xì)胞中淀粉體降解，淀粉顆粒體積變小，游離在細(xì)胞解體后的空間中（圖2E、F）。花后20d，中果皮細(xì)胞幾乎全部解體，內(nèi)含物消失，僅留存擠壓皺縮的多層細(xì)胞壁殘痕（圖2H）?；ê?5d，中果皮及其中的淀粉體全部降解消失。殘余細(xì)胞壁進(jìn)一步壓縮，細(xì)胞間隙縮小，外果皮和內(nèi)果皮發(fā)生接觸。整個果皮僅保留5～6層細(xì)胞。

圖2 小麥腹部頂端果皮的發(fā)育和衰亡

內(nèi)果皮的橫細(xì)胞和管細(xì)胞差異較明顯。由花后5d顯微結(jié)構(gòu)可見，細(xì)胞內(nèi)含物較多，染色較深，其中橫細(xì)胞的尺寸較大，細(xì)胞核大而明顯。2層細(xì)胞均排列規(guī)則而緊密。在管細(xì)胞靠近珠被的一側(cè)可見1層染色較深的角質(zhì)層，而且角質(zhì)層在穎果發(fā)育過程中始終存在，界限清晰（圖2B）?；ê?0d，橫細(xì)胞形狀變得不規(guī)則，細(xì)胞核消失；管細(xì)胞的核顏色變淺，細(xì)胞長度橫向有所增加（圖2D）?；ê?5d，橫細(xì)胞的壁增厚，細(xì)胞內(nèi)有小淀粉體分布；管細(xì)胞變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞間隙增大明顯（圖2F）?；ê?0d，橫細(xì)胞形狀更加不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)仍存在少量淀粉體；管細(xì)胞發(fā)生較明顯降解，產(chǎn)生大量細(xì)胞間隙。到花后25d，橫細(xì)胞內(nèi)含物消失不見，呈橫長條形；僅殘留少量管細(xì)胞；兩者細(xì)胞壁均有較明顯增厚（圖2 H、J）。

圖3 小麥果皮和胚乳中淀粉體的比較

2.3 種子成熟過程中果皮細(xì)胞和胚乳細(xì)胞中淀粉體的比較

對比花后15d與25d的腹部和背部果皮細(xì)胞以及胚乳細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，二者在淀粉體形態(tài)、積累和降解規(guī)律等方面均有明顯差異。果皮中淀粉體有復(fù)粒淀粉體和單粒淀粉體2種形態(tài)；胚乳細(xì)胞中均為單粒淀粉體且體積更大。背部折痕區(qū)果皮細(xì)胞中淀粉體數(shù)量和體積遠(yuǎn)大于腹部果皮，且復(fù)粒淀粉體比例更大，每個淀粉體有多個淀粉粒，而且有較明顯的邊緣，界線清晰可見。果皮細(xì)胞中的淀粉體隨著穎果發(fā)育最終降解消失，而胚乳細(xì)胞中的淀粉體數(shù)量不斷增多，體積不斷增大。花后25d，果皮只剩下空細(xì)胞；胚乳細(xì)胞被淀粉體完全充實(shí)，有體積較大但數(shù)量少和體積小但數(shù)量大的兩種淀粉體存在。因此，果皮中的淀粉體是臨時(shí)性的，僅用于某個發(fā)育階段的養(yǎng)分供應(yīng)；胚乳中的淀粉體是貯藏性的，也是小麥種子中最主要的淀粉貯存場所。

3 討 論

隨著穎果發(fā)育成熟，果皮有明顯的衰亡過程。這一方面是由于灌漿充實(shí)，胚乳體積的增加速率遠(yuǎn)大于穎果體積的增加速率，因此向外擠壓果皮，由于外果皮細(xì)胞壁較厚、內(nèi)果皮內(nèi)側(cè)存在角質(zhì)層，不容易破損，因此機(jī)械壓力主要集中到中果皮薄壁細(xì)胞，使細(xì)胞解體，果皮體積被壓縮。另一方面是細(xì)胞程序性死亡主動適應(yīng)穎果成熟的結(jié)果，果皮細(xì)胞的凋亡既可為由于某些原因而不再需要的細(xì)胞提供一個有效的清除機(jī)制，又可以形成有利于個體自身發(fā)展所需的物質(zhì)而被加以回收利用［15－16］。

揚(yáng)麥16果皮花后10d開始的凋亡是有序進(jìn)行的，細(xì)胞逐層破損，其中淀粉體等逐漸降解，供應(yīng)周圍細(xì)胞充分吸收和利用。揚(yáng)麥16果皮細(xì)胞核消失的過程較長，直到花后25d仍可觀察到少數(shù)細(xì)胞核，這與余徐潤等研究發(fā)現(xiàn)相似。余徐潤等認(rèn)為，果皮細(xì)胞去核過程中伴隨有葉綠體的出現(xiàn)與降解；內(nèi)果皮細(xì)胞中葉綠體的光合效率甚至高于旗葉，能合成淀粉并釋放氧氣，維持了細(xì)胞的存活［7］；王利凱也推測由于果皮細(xì)胞中早期合成的淀粉顆粒不斷被降解，后期葉綠體光合作用又能合成光合同化物，因此細(xì)胞一直都有足夠的能量補(bǔ)充以維持生存［17］。而當(dāng)后期果皮中葉綠體解體，貯藏的淀粉顆粒消耗盡時(shí)，細(xì)胞獲得的能量不足以維持其生存，果皮細(xì)胞才開始快速凋亡，剩下僅存細(xì)胞壁的幾層細(xì)胞。

綜上所述，小麥穎果的外果皮作為主要保護(hù)結(jié)構(gòu)而得以保留和強(qiáng)化；中果皮細(xì)胞前期儲存較多淀粉體，可為果皮提供階段性的營養(yǎng)物質(zhì)；內(nèi)果皮的光合放氧和合成有機(jī)物的功能，也是果皮存活和發(fā)揮生理功能的特殊保障機(jī)制。同時(shí)，果皮發(fā)生的上述變化不僅是穎果本身的發(fā)育結(jié)果，也與植株整體的成熟和衰老這一特定生理過程密切相關(guān)。小麥果皮發(fā)育與衰亡的深層機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究和解析。

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