谷子ABC轉運蛋白基因與抗旱關系的研究

張瑞杰，王喆，連卜穎，郭展，魏東，于世慧，李紅英,2,3*，劉曉東

(1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.農業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031；3.雜糧種質資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷 030801;4.山西省農業(yè)科學院 作物科學研究所，山西 太原 030031)

谷子(Setariaitalica)，禾本科，狗尾草屬，是中國傳統(tǒng)的糧食作物，距今已有7500多年的栽培歷史[1]。研究表明，谷子具有豐富的營養(yǎng)價值，各種成分均衡、飼草蛋白含量高，且具有很高的水分利用效率、抗旱耐瘠、適應性廣等突出特點[2～4]。因此，谷子在我國農業(yè)生產中占有舉足輕重的地位。在中國，谷子主要分布在北方黃河流域中上游的干旱、半干旱地區(qū)。由于地區(qū)性降水不均，大部分區(qū)域降水較少，干旱成為制約谷子品質與產量提高的主要問題[5]。因此，選育抗旱能力強，適應范圍廣的谷子品種是目前育種的主要方向之一。

ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporters)是一類跨膜蛋白，廣泛存在于自然界生物體中，是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一[6]，在植物的抗逆脅迫中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實ABC轉運蛋白廣泛參與植物的抗逆反應[7]，如浮萍中的PDR基因SpTUR2受干旱、ABA、低溫和鹽的誘導表達[8]；擬南芥中AtABCG40基因的表達能夠促進植物的抗旱能力以及對金屬鉛的耐受力[9]；在擬南芥中AtABCG36基因過表達可以提高植株對干旱與鹽脅迫的抗性，參與植物的抗旱反應[7]；AtABCC5、AtABCG31通過調節(jié)氣孔開閉，增強植物的抗逆性[10，11]；水稻中的OsABCG36基因可以對干旱、ABA等脅迫做出應答反應[8]；在高鹽、干旱等逆境條件下，水稻ABCB基因家族中均有表達[12]；小麥中的TaPDR1基因參與植物抗病防御反應[13]。

目前擬南芥、水稻ABC轉運蛋白的研究較多，分別有129個和128個ABC轉運蛋白基因被發(fā)掘[14]，而谷子中關于ABC轉運蛋白的研究相對較少，對ABC轉運蛋白基因與谷子抗旱關系的研究更是微乎其微。為了更好地了解ABC轉運蛋白與谷子抗旱的關系，本文根據PEG脅迫處理下的抗旱品種(GG)和干旱敏感品種(JF)的轉錄組數據，分析了兩個品種中與干旱相關的ABC轉運蛋白基因的基本信息和表達情況，并利用生物信息學方法，進一步分析了起始密碼子上游1 500 bp的啟動子順式作用元件，并構建進化樹比較這些基因親緣關系的遠近。初步了解谷子ABC轉運蛋白基因與谷子抗旱的關系，并推測Seita.7G176000.1可能是谷子抗旱候選基因，研究結果為后續(xù)該蛋白基因的功能鑒定和研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料為抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)，由山西農業(yè)大學提供。將谷子幼苗置于人工氣候室，14 h光照28 ℃/10 h黑暗23 ℃培養(yǎng)，出苗后每3天澆一次蒸餾水，培養(yǎng)3周后，釆用20% PEG-6000干旱處理0.5 h，用蒸餾水處理相同時間做對照，每個處理隨機選取3株用于RNA提取，進行表達譜測序。

1.2 研究方法

利用Phytozome v 11.0豫谷1號基因組數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進行關鍵詞搜索，獲取谷子ABC轉運蛋白基因的基本信息；利用網站http://web.expasy.org/compute_pi/在線預測蛋白質分子量和理論等電點理化性質；利用MEGA 7.0進行氨基酸序列比對，構建系統(tǒng)進化樹；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析啟動子順式元件。

2 結果與分析

2.1 谷子ABC轉運蛋白基因基本信息及理化性質分析

通過Phytozome v 11.0豫谷1號基因組數據庫獲取了谷子ABC轉運蛋白基因信息并通過網站http://web.expasy.org/compute_pi/在線預測蛋白質分子量和理論等電點，結果如表1所示。4個ABC轉運蛋白基因分布在3條不同的染色體上，分別位于1，5，7號染色體的不同位點。不同的基因其基因組序列有很大區(qū)別，最長為9 254 bp，而最小的只有3 384 bp；Seita.5G185300.1蛋白最長有1 447個氨基酸，Seita.1G086300.1蛋白最短有457個氨基酸，相對應的蛋白分子量范圍在51 195.75～161 579.13Da之間，CDS序列長度在1 374～4 344 bp之間；等電點預測發(fā)現，除Seita.1G039400.1的等電點為6.81顯酸性外，其他3個基因均顯堿性。

表1 谷子部分ABC轉運蛋白基因基本信息Table 1 Basic information of some ABC transporter protein genes in foxtail millet

使用GSDS2.0對ABC轉運蛋白基因進行基因組結構繪制，結果如圖1所示。除Seita.1G086300.1沒有內含子以外，其他3個均含有內含子和外顯子結構，其中Seita.1G039400.1內含子數目最多(Seita.1G039400.1)為18個，Seita.5G185300.1和Seita.7G176000.1都含有8個內含子；Seita.5G185300.1有較長的上游序列，而Seita.7G176000.1有較長的下游序列。

圖1 谷子ABC轉運蛋白基因內含子-外顯子結構Fig.1 Intron-exonstructures of ABC translocation protein genes in foxtail millet

2.2 谷子ABC轉運蛋白基因與其他植物ABC抗逆相關基因系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA7.0對4個谷子ABC轉運蛋白基因及5個其他植物ABC抗逆相關基因進行系統(tǒng)進化樹分析，比較其親緣關系的遠近(圖2)。從圖2可以看出，Seita.1G039400.1和Seita.7G176000.1親緣關系最近，其次與AtABCC5親緣關系較近；Seita.1G086300.1與AtABCG36和AtABCG31親緣關系較近。

2.3 谷子ABC轉運蛋白基因啟動子元件分析

谷子ABC基因中與干旱脅迫相關的元件主要有脫落酸響應元件ABRE、水楊酸響應元件TCA-element、熱脅迫響應元件HSE、低溫響應元件LTR、脅迫響應元件TC-rich repeats以及MYB元件等。以豫谷1號序列為參照，選取起始密碼子上游1 500 bp序列為啟動子區(qū)，利用PlantCARE在線分析這4個ABC轉運蛋白基因啟動子區(qū)元件。將啟動子順式元件歸類，進行統(tǒng)計分析(表2)。結果顯示，不同基因的調控元件總數不同，Seita.1G039400.1基因的順式調控元件最多，高達75個，Seita.5G185300.1基因最少，含有51個順式調控元件；其中只有Seita.1G086300.1基因含有ABRE調控元件，只有Seita.1G039400.1 基因含有水楊酸響應調控元件；Seita.1G039400.1 基因所含的茉莉酸甲酯響應元件最多，高達8個；此外，在這4個ABC轉運蛋白基因中，啟動子區(qū)均含MYB元件，MYB屬于轉錄因子，與干旱、ABA的誘導表達有關。

圖2 谷子ABC轉運蛋白基因與其他植物ABC抗逆相關基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of ABC translocation protein genes in foxtail millet and ABC tolerance genes in other plants

表2 谷子部分ABC蛋白基因啟動子順式元件預測Table 2 Predicted cis acting elements of partial ABC transporter protein in foxtail millet

注：以上數據不包括基本啟動子元件TATA-box和CAAT-box。
Note：The data does not include the basic promoter elements such as TATA-box and CAAT-box.

圖3 GG和JF16 ABC轉運蛋白基因的表達水平Fig.3 Expression levels of expansin ABC transporter genes in GG and JF16

2.4 谷子ABC轉運蛋白基因在干旱脅迫下的表達模式分析

用20% PEG-6000模擬干旱脅迫，處理抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)，對其ABC轉運蛋白基因進行表達譜分析。

由圖3可見，GG和JF16基因組中有4個基因(Seita.1G086300.1、Seita.1G039400.1、Seita.5G185300.1、Seita.7G176000.1)均表達。2個品種的Seita.1G086300.1基因在正常澆水與干旱脅迫下均有表達。正常澆水情況下，抗旱品種GG的表達量高于干旱敏感品種JF16；干旱脅迫下，這兩個品種的表達量均下調，且GG下調幅度較JF16高。正常澆水情況下，干旱敏感品種JF16的Seita.1G039400.1的表達量高于抗旱品種GG；干旱脅迫下，2個品種的Seita.1G039400.1的表達量均下調，且JF16下調幅度較GG高。在干旱脅迫下，Seita.5G185300.1基因在抗旱品種GG中不表達，但在正常澆水情況下表達水平上調；JF16的Seita.5G185300.1基因在正常澆水與干旱脅迫下都表達，且無明顯差異。JF16的Seita.7G176000.1 基因在正常生長條件下表達水平較GG高；在干旱脅迫后表達水平都上調，且GG上調幅度較JF16高。

3 結論與討論

干旱嚴重影響著作物的品質與產量[5]，谷子作為抗旱作物，研究其抗旱機理對于選育抗旱新品種具有重要的意義。本文通過對谷子中ABC轉運蛋白基因進行生物信息學分析以及表達譜分析，初步探討ABC轉運蛋白基因與谷子抗旱的關系。

ABC轉運蛋白是植物中重要的抗逆蛋白。通過分析谷子中編碼ABC轉運蛋白的基因序列，發(fā)現其啟動子序列中含有許多抗逆相關的元件，如脫落酸響應元件ABRE、水楊酸響應元件TCA-element、熱脅迫響應元件HSE、低溫響應元件LTR、脅迫響應元件TC-rich repeats以及MYB元件等。谷子具有抗旱耐瘠的特性，結合實際情況，推測其可能參與谷子抗旱調節(jié)。

ABRE是ABA合成時所需要的相關元件，ABA與抗旱息息相關。試驗發(fā)現Seita.1G086300.1含有的ABRE元件最多，另外，系統(tǒng)進化樹表明Seita.1G086300.1基因與AtABCG36和AtABCG31親緣關系較近，已有研究表明在擬南芥中AtABCG36基因的過表達可以提高植株對干旱與鹽脅迫的抵抗能力，參與植物的生物脅迫[7]。但是在表達譜分析中，抗旱品種GG在20%PEG處理后Seita.1G086300.1表達量下降，與啟動子分析結果以及系統(tǒng)進化樹結果不一致。這可能是因為該基因上游含有其他負調控轉錄因子，使得GG在干旱脅迫處理中Seita.1G086300.1基因表達量下降，有待進一步證實。20%PEG脅迫下(同正常澆水相比)，Seita.7G176000.1 基因在抗旱品種GG中表達水平的上調幅度顯著大于干旱敏感品種JF16，系統(tǒng)進化樹中，Seita.7G176000.1 基因與AtABCC5親緣關系較近。這可能是由于抗旱品種中Seita.7G176000.1基因的高水平表達，促使植物調節(jié)氣孔開閉，提高對干旱的抵抗能力，該結果與趙胡等人的研究結果是一致的[10]。

綜上所述，本研究通過對谷子ABC轉運蛋白基因進行生物信息學分析，并分析干旱處理下其表達情況，初步了解ABC轉運蛋白基因與谷子抗旱的關系，并推測Seita.7G176000.1 ABC轉運蛋白基因可能為谷子抗旱候選基因，研究結果為進一步探究ABC轉運蛋白基因在谷子響應干旱脅迫過程中的作用提供依據。

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