禾谷鐮孢復合種毒素化學型及遺傳多樣性分析

馬紅霞，孫華，郭寧，張海劍，石潔，常佳迎

（河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

0 引言

【研究意義】禾谷鐮孢復合種（Fusarium graminearumspecies complex，F(xiàn)GSC）是引起中國玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌之一[1]，病原菌通過氣流傳播[2-4]。該病原菌不僅可直接危害果穗，影響種子萌發(fā)，降低玉米品質(zhì)及產(chǎn)量；其產(chǎn)生的毒素主要為雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其衍生物15-ADON和3-ADON，對人畜健康造成很大威脅[5-9]，給產(chǎn)后貯藏加工帶來嚴重影響[10]。禾谷鐮孢復合種有較高的遺傳變異[11]，不同地理環(huán)境其遺傳變異率不同[12]。研究發(fā)現(xiàn)，2015年北方春玉米區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌為禾谷鐮孢復合種[13]，但對引起該區(qū)域的穗腐病禾谷鐮孢復合種的來源問題未見報道。對來自不同省份禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性進行研究，明確各地種群和東北春玉米區(qū)種群間的親緣關(guān)系，對病害防控和預測預報具有重要意義。【前人研究進展】禾谷鐮孢復合種侵染谷物籽粒產(chǎn)生的毒素類型主要為單端孢烯族化合物，控制該化合物生物合成基因的研究較多。LEE等研究發(fā)現(xiàn)，Tri13和Tri7是鐮孢菌單端孢烯族化合物決定生物合成最終產(chǎn)物為 DON還是NIV的關(guān)鍵基因[14-15]；CHANDLER等[16]根據(jù)這2個關(guān)鍵基因設計了Tri7F/DON、Tri7F/NIV和Tri13F/DONR、Tri13NIVF/R等?；砸?，用于區(qū)分產(chǎn)DON和NIV毒素類型；董懷玉等[17]利用上述專化性引物對分離自中國北方春玉米區(qū)玉米籽粒的禾谷鐮孢復合種進行產(chǎn)毒素化學型檢測，發(fā)現(xiàn)F. graminearum只產(chǎn)生DON，F(xiàn). asiaticum可以產(chǎn)生DON和NIV。Tri3控制C-15位置的乙酰化反應，JENNINGS等[18]根據(jù)基因序列設計引物用于進一步區(qū)分黃色鐮孢（F. culmorum）產(chǎn)DON菌株的乙酰化產(chǎn)毒類型；李偉等[19]利用Tri3專化性引物發(fā)現(xiàn)長江流域產(chǎn) 3-AcDON毒素的F.asiaticum是引起小麥赤霉病的優(yōu)勢種群；紀莉景[20]采用Tri13和Tri3?；砸锓治龊坦如犳叩漠a(chǎn)毒類型，明確了中國禾谷鐮孢產(chǎn)毒類型為NIV、15-ADON和3-ADON，并且它們的分布與地域有關(guān)?；赑CR的分子標記技術(shù)越來越多地應用于鐮孢菌遺傳多樣性分析，例如隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）[21]、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）[22]、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）[23]、簡單序列重復間區(qū)的DNA序列（inter simple sequence repeat，ISSR）[24]、延伸因子（EF-1α）[19]等。有關(guān)玉米穗腐病病原菌禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性也有報道[20,25-26]。紀莉景[20]采用RAPD技術(shù)確定中國存在 3類禾谷鐮孢進化群lineage7、lineage6和 lineage3，并發(fā)現(xiàn)每一類群內(nèi)各地理來源菌株間存在豐富的遺傳多樣性；董懷玉等[25]利用禾谷鐮孢復合種特異性引物 Fg16F/R，明確北方春玉米區(qū)玉米穗腐病病原菌禾谷鐮孢復合種存在SCAR類型1和類型5；任旭[26]采用VNTR和SSR標記對禾谷鐮孢復合種進行遺傳多樣性分析，表明產(chǎn)毒化學型和地域分布對多樣性分析有一定影響。ISSR標記是基于PCR的分子標記技術(shù)，擴增譜帶為顯性，數(shù)據(jù)可靠且可重復，多態(tài)性較高，廣泛應用于鐮孢菌遺傳多樣性分析[11,27-30]。ALBAYRAK等[9]利用ISSR技術(shù)發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢和黃色鐮孢在種內(nèi)和種間均具有遺傳變異，且毒素類型和鐮孢菌種類與地理區(qū)域有相關(guān)性?！颈狙芯壳腥朦c】禾谷鐮孢復合種目前為止已確定至少由 15種不同的病原菌組成[1]。不同地理來源的禾谷鐮孢復合種產(chǎn)毒類型不同且存在較高的遺傳變異。ISSR技術(shù)在鐮孢菌種間和種內(nèi)進行遺傳分析過程中均能表現(xiàn)出明顯的遺傳差異性，可用于鐮孢菌遺傳多態(tài)性的分析研究，但用于玉米穗腐病病原菌禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性分析未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用基因Tri13和Tri3特異性引物分析不同省（自治區(qū)）禾谷鐮孢復合種產(chǎn)毒類型，利用ISSR技術(shù)分析其遺傳多樣性，明確各地種群間的親緣關(guān)系，為該病害流行、預測預報、防控及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2015—2016年在河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所完成。

1.1 材料

于2015年采集北方春播區(qū)（甘肅、內(nèi)蒙古、黑龍江、遼寧、吉林、山西、河北張家口及唐山）和黃淮海夏播區(qū)（河北石家莊、河南、山東、安徽、江蘇）的玉米穗腐病病樣，通過組織分離法分離得到92株禾谷鐮孢復合種菌株（表1），采用艾德萊真菌基因組提取試劑盒提取這些菌株的菌絲DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試禾谷鐮孢復合種的來源、編號和毒素化學型Table 1 Origin, number and toxigenic chemotype of FGSC in this study

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 禾谷鐮孢復合種毒素化學型檢測

根據(jù)Tri13和Tri3序列設計的特異性引物（表2）分析禾谷鐮孢復合種的產(chǎn)毒類型。PCR反應體系為2×Es TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，Template 1 μL，加 ddH2O 補足至25 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火（視不同引物而定）45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上以120 V電泳30 min，使用GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)照相。

表2 本研究所用特異性引物Table 2 Specific primer pairs used in this study

1.3 ISSR分析

1.3.1 ISSR引物篩選 隨機選擇不同地區(qū)的4個菌株的DNA等量混合成DNA模板，對加拿大哥倫比亞大學（University of British Columbia，UBC）公布的100個ISSR引物進行初步篩選，選擇擴增條帶豐富、重復性好、信號強、背景清晰的引物用于全部 92個DNA樣品的擴增。

1.3.2 ISSR-PCR體系及程序 PCR反應體系為2×Es TaqMasterMix 10 μL，Primer（10 μmol·L-1）1.5 μL，Template 1 μL，加 ddH2O 補足至 20 μL。采用的13個引物見表2。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火（視不同引物而定）45 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上以120 V電泳30 min，使用GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)照相。擴增出2種及以上不同的條帶即為多態(tài)性引物。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 對ISSR電泳譜帶進行記錄，在相同位置出現(xiàn)條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，缺失條帶記為“9”或“. ”。使用 Popgen32軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算 Shannon’s多樣性指數(shù)、群體間的遺傳距離和遺傳相似性[32]；利用NTsys2.10e軟件，采用clustering模塊中的SAHN進行UPGMA聚類分析，并構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 禾谷鐮孢復合種毒素化學型PCR分析

利用引物Tri13F/Tri13R可同時鑒定NIV（415 bp）和DON（234 bp）（圖1-A）。92株菌株只有江蘇菌株JS2可產(chǎn)生NIV，有56個（60.87%）菌株可產(chǎn)生DON（表1），表明北方春玉米區(qū)和黃淮夏玉米區(qū)禾谷鐮孢復合種產(chǎn)生的主要毒素化學型為 DON。引物Tri315F/Tri315R擴增的目的條帶大約為 870 bp（圖1-B），有76株（82.61%）菌株可產(chǎn)生15-ADON（表3）。引物Tri303F/Tri303R沒有擴增出目的條帶，表明92株菌株不能產(chǎn)生3-ADON。

圖1 部分禾谷鐮孢復合種菌株產(chǎn)毒素化學型的PCR檢測Fig. 1 Detection of toxigenic chemotypes of some FGSC isolates by PCR assay

綜合分析表1和表3可知，僅有江蘇菌株JS2能產(chǎn)生NIV和15-ADON；有55株（59.78%）可同時產(chǎn)生 DON和 15-ADON；有 20株（21.74%）僅產(chǎn)生15-ADON；山西菌株SX29只產(chǎn)生DON；但有15株（16.30%）即不產(chǎn)生DON也不產(chǎn)生NIV。

表3 禾谷鐮孢復合種毒素化學型的地域差異Table 3 Regional variation in toxigenic chemotypes of FGSC

2.2 ISSR-PCR擴增

從100個引物中篩選出13個擴增條帶豐富、重復性好、信號強、背景清晰的引物。所選的13個引物對11個?。ㄗ灾螀^(qū)）的92個菌株進行ISSR-PCR擴增（圖2），結(jié)果如表4所示。共獲得102個條帶，其中多態(tài)性條帶101個，占99.02%。擴增的DNA片段大小在200—2 500 bp。不同引物擴增條帶數(shù)不等，條帶數(shù)在2—14條，多數(shù)為7—9條，平均每條引物產(chǎn)生多態(tài)性條帶7.85條。其中866號引物擴增出的條帶數(shù)最多（14條）；而引物855擴增出的條帶數(shù)最少（2條）。除引物855的多態(tài)性條帶為50%外，其余引物均為100%。

圖2 6個引物對部分禾谷鐮孢復合種菌株基因組DNA的ISSR-PCR擴增Fig. 2 Amplification of genome DNA of some FGSC isolates with 6 primers

表4 ISSR引物擴增Table 4 The amplification with ISSR primers

2.3 不同地理種群禾谷鐮孢復合種遺傳多態(tài)性

對禾谷鐮孢復合種菌株按不同省（自治區(qū)）來源分為11組，其多態(tài)性分析如表5所示。在群體平均水平上，多態(tài)性位點為101個，多態(tài)性位點比率為 99.02%，有效等位基因數(shù)（NE）為 1.5207，基因多樣性指數(shù)（H）為0.3129，Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.4774，表明禾谷復合種群體存在豐富的遺傳變異。就各地區(qū)而言，H值在0.1421—0.3160，I值在 0.2075—0.4744，表明禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性在不同地理種群間存在一定差異。河北、山西、黑龍江和吉林種群遺傳多樣性最高，內(nèi)蒙古和遼寧種群次之，山東、江蘇和甘肅種群較低，安徽和河南種群最低。

分析得到 11個地理種群總基因多樣性 Ht為0.3101，各地理種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.2257，地理群體間的基因多樣性Dst為0.0844，表明相同省份來源的菌株具有較近的親緣關(guān)系。地理種群間的基因分化系數(shù)Gst為0.2722，這說明不同地理種群間遺傳變異占種群總遺傳變異的 27.22%，大部分遺傳變異（72.78%）發(fā)生在種群內(nèi)。根據(jù)遺傳分化系數(shù)估算的基因流的值 Nm=1.3372（＞1），表明種群間存在一定的基因流動。

2.4 不同地理種群禾谷復合體遺傳相似性

11個地理種群間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)如表6所示，不同地理種群間的遺傳相似性為0.7920—0.9997，遺傳距離為0.0003—0.2332。根據(jù)遺傳相似性和遺傳距離分析，河北、山西、黑龍江和吉林菌株群體間相似系數(shù)最大，遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近；其次是山東與江蘇菌株間，以及遼寧與吉林菌株間的親緣關(guān)系較近，相似系數(shù)均為0.96；內(nèi)蒙古、甘肅和河南的菌株與上述這些地區(qū)的親緣關(guān)系較遠；安徽和內(nèi)蒙古菌株間的親緣關(guān)系最遠，相似系數(shù)為0.7920，遺傳距離為0.2332。

2.5 禾谷鐮孢復合體ISSR聚類分析

利用NTsys2.10e軟件對92個菌株進行ISSR聚類分析，結(jié)果如圖3所示，菌株間具有豐富的遺傳多樣性，相似系數(shù)在0.43—0.95。在相似系數(shù)為0.43時，所有的菌株被分成2大類群，Group 1包括4株北方春播區(qū)菌株（吉林、山西和河北張家口），這些菌株既不產(chǎn)生NIV也不產(chǎn)生DON；Group 2由余下的88株菌株構(gòu)成，這些菌株產(chǎn)生的毒素類型主要為DON和 15-ADON，其來源于北方春播區(qū)（山西、黑龍江、吉林、遼寧、甘肅和河北張家口、唐山）和黃淮海夏播區(qū)（河北石家莊、河南、山東、江蘇和安徽），雖然圖3顯示它們交叉聚在一起，但大部分春播區(qū)菌株聚在一起，較多的夏播區(qū)菌株聚在一起。

表5 禾谷鐮孢復合種不同地理種群的遺傳多樣性水平Table 5 Genetic diversity parameters among geographic populations of FGSC

表6 禾谷鐮孢復合種不同地理種群間的遺傳相似性和遺傳距離Table 6 Genetic identity and genetic distance among geographic populations of FGSC

在相似系數(shù)為0.56時，92個菌株可劃分成9個群。A群和B群組成Group 1；C群由76.08%的菌株組成，該群在相似系數(shù)為0.664水平上又分成6個亞群，Ⅰ

亞群由34株春播區(qū)菌株（山西、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅和河北張家口）組成，Ⅱ亞群由 9個春播區(qū)菌株（內(nèi)蒙古、山西、遼寧、吉林和黑龍江）和 7株夏播區(qū)菌株（山東、河南、江蘇和河北石家莊）組成，Ⅲ亞群由5個春播區(qū)菌株（山西、吉林、黑龍江和遼寧）和 3株夏播區(qū)菌株（河北石家莊和江蘇）組成，Ⅳ亞群由 1株吉林菌株組成，Ⅴ亞群由 9株春播區(qū)菌株（吉林、黑龍江、山西、甘肅和河北張家口）組成，Ⅵ亞群由3株山西菌株組成；D群由 1株安徽菌株構(gòu)成；E群由 1株山西菌株和 3株夏播區(qū)菌株（江蘇、山東和安徽）構(gòu)成；F群由4株春播區(qū)菌株（內(nèi)蒙古、黑龍江和河北唐山）構(gòu)成；G群由2株春播區(qū)菌株（吉林和遼寧）和1株河南菌株構(gòu)成；H群由1株河北張家口菌株構(gòu)成；I群由4株春播區(qū)菌株（黑龍江、遼寧、山西和河北張家口）和1株山東菌株構(gòu)成。

圖3 禾谷鐮孢復合種菌株的UPGMA聚類圖Fig. 3 Dendrogram obtained by UPGMA clustering for FGSC isolates

3 討論

鐮孢菌屬真菌是玉米上的重要病原菌，能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，可引起玉米的穗腐病、莖腐病和根腐病等。其中禾谷鐮孢復合種是引起玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌之一，禾谷鐮孢復合種主要產(chǎn)生的毒素化學型為NIV和DON及其衍生物3-ADON和 15-ADON；化學型的產(chǎn)生類型與地域有一定的關(guān)系，在中國冷涼地區(qū)一般以15-ADON為主，溫暖地區(qū)如長江流域以3-ADON和NIV為主[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)分離自春玉米區(qū)禾谷鐮孢復合種的毒素化學型主要為DON和15-ADON，夏玉米區(qū)禾谷鐮孢復合種產(chǎn)生的毒素化學型主要為 DON和15-ADON，個別菌株可產(chǎn)生NIV。該研究結(jié)果與以上結(jié)論一致。

基于 PCR的分子標記技術(shù)廣泛應用于鐮孢菌遺傳多樣性研究，大部分的分子標記技術(shù)以基因組DNA為靶標，比如 RAPD、RFLP等，還有部分以線粒體DNA為模板。ISSR標記技術(shù)是以基因組DNA為模板的技術(shù)，揭示的多態(tài)性較高，檢測非常方便，廣泛應用于鐮孢菌多樣性分析。本研究利用13個多態(tài)性豐富的ISSR引物對來自11個省（自治區(qū)）的92個禾谷鐮孢復合種菌株進行遺傳多樣性分析，共擴增出 102個條帶，其中多態(tài)性條帶為 101個，多態(tài)性比率為99.02%，表明禾谷鐮孢復合種群體存在豐富的遺傳變異，這一結(jié)果與QU等[33]對禾谷鐮孢菌群體的研究結(jié)果一致。

生物群體的遺傳多樣性是評價生物資源狀況的重要依據(jù)之一，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）是衡量生物遺傳多樣性的重要參數(shù)。本研究在群體平均水平上，H為0.3129，I為 0.4774，表明禾谷鐮孢復合種存在較高的遺傳多樣性水平。11個地理種群的 H值和I值的計算結(jié)果趨勢一致，均為河北、山西、黑龍江和吉林種群遺傳多樣性最高，安徽和河南種群最低。這可能與來自安徽和河南的菌株數(shù)目較少有關(guān)。何婧等[34]認為各采集地點禾谷鐮孢菌數(shù)量的增加可提高遺傳多樣性水平。

不同地理種群總基因多樣性（Ht）為0.3101，種群內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.2257，地理種群間的基因分化系數(shù)（Gst）為0.2722，說明不同地理種群間存在一定的遺傳變異，但大部分遺傳變異（72.78%）發(fā)生在種群內(nèi)。瞿波[35]通過AFLP標記技術(shù)發(fā)現(xiàn)同一來源地的菌株很難找到相同的個體，說明禾谷鐮孢復合種群體內(nèi)存在廣泛的遺傳變異。

根據(jù)遺傳分化系數(shù)估算的基因流值 Nm=1.3372（＞1），表明不同地理種群間存在一定的基因流動，這一結(jié)果通過對地理種群間親緣關(guān)系的分析進一步得到證實。根據(jù)遺傳相似性和遺傳距離分析，發(fā)現(xiàn)河北、山西、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和甘肅菌株群體間親緣關(guān)系較近，山東、江蘇、河南和安徽菌株間親緣關(guān)系較近，安徽和內(nèi)蒙古菌株間的親緣關(guān)系最遠，這表明菌株間的親緣關(guān)系與地理來源有關(guān)。進一步對92個菌株的聚類結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)北方春玉米區(qū)菌株（山西、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和河北張家口及唐山）聚在一起，黃淮海夏玉米區(qū)菌株（河北石家莊、山東、江蘇、安徽和河南）趨向在一起，而且各個地理來源的菌株趨向聚在一起，同樣說明禾谷鐮孢復合種間的遺傳多樣性與生態(tài)環(huán)境有關(guān)，這與前人研究結(jié)果一致。瞿波[35]認為中國的禾谷鐮孢存在溫暖型菌系和冷涼型菌系兩種類型，具有明顯的生態(tài)地理劃分；何婧等[34]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢復合種間遺傳多樣性與其地理來源有一定的關(guān)系；董懷玉等[25]通過對禾谷鐮孢復合種 SCAR類型測定發(fā)現(xiàn)玉米穗腐病禾谷鐮孢菌存在明顯的生態(tài)地理類型。在相似系數(shù)為 0.664時，C群分為 6個亞群，其中Ⅱ和Ⅲ亞群均包含春玉米區(qū)菌株和夏玉米區(qū)菌株，說明這些菌株親緣關(guān)系較近，表明春玉米區(qū)穗腐病病原菌以本地菌源為主，但不排除部分病原菌可從夏玉米區(qū)遠距離氣傳的可能。下一步研究應加大上述區(qū)域穗腐病病原菌禾谷鐮孢復合種的采集范圍和數(shù)量，以明確春玉米區(qū)穗腐病病原菌禾谷鐮孢復合種的來源。

4 結(jié)論

北方春玉米區(qū)和黃淮海夏玉米區(qū)引起玉米穗腐病的禾谷鐮孢復合種主要毒素化學型為 DON和15-ADON?；贗SSR技術(shù)，表明禾谷鐮孢復合種群體內(nèi)存在豐富的遺傳變異；相同地理來源的菌株有較近的親緣關(guān)系，且不同地理種群間也存在一定的基因交流，遺傳多樣性水平與地理來源有關(guān)。

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