田燁，吳明媛

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生物制品凍干保護(hù)方法研究進(jìn)展

田燁，吳明媛

200010 上海交通大學(xué)藥學(xué)院

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的生物制品以凍干粉針的劑型被不斷研究出來并應(yīng)用于臨床。雖然冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用于生物制品具有許多優(yōu)勢，但同時(shí)生物制品在冷凍干燥的過程中也容易發(fā)生變性導(dǎo)致藥物效價(jià)降低。在技術(shù)上為了降低冷凍干燥對生物制品的不良影響，往往采用添加輔料或者優(yōu)化凍干工藝這兩種方法。本文綜述了可提高生物制品穩(wěn)定性，應(yīng)對或降低生物制品變性的冷凍干燥技術(shù)的最新研究進(jìn)展。

1 冷凍干燥的原理及過程

冷凍干燥技術(shù)是將液態(tài)的藥液降溫凍結(jié)成固體，然后在真空環(huán)境下進(jìn)行升華干燥以除去冰晶，升華結(jié)束后同樣于真空環(huán)境下進(jìn)行解析干燥以除去結(jié)合水[1]。藥物冷凍干燥的過程主要分為 4 個(gè)步驟：預(yù)凍、升華干燥（一次干燥）、解析干燥（二次干燥）、密封保存。依照上述步驟凍干后的藥品可以室溫或冷藏進(jìn)行長期儲存，需要使用的時(shí)候，添加合適的溶劑復(fù)溶后，便可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。而生物制品在上述冷凍干燥及保存的過程中都有變性的可能。

2 改善凍干生物制品變性降解的措施

為應(yīng)對或減少生物制品在凍干過程及長期保存中的變性，通常會采用兩種方式，即在處方中添加保護(hù)劑和優(yōu)化凍干工藝。

2.1 添加保護(hù)劑

凍干保護(hù)劑是凍干制劑中的一種添加劑，能夠減少或阻止冷凍干燥過程對蛋白造成的變性影響。根據(jù)凍干冷凍過程和干燥過程對蛋白質(zhì)施加應(yīng)力的不同，將蛋白質(zhì)保護(hù)劑的作用機(jī)制分為冷凍保護(hù)機(jī)制和干燥保護(hù)機(jī)制。冷凍保護(hù)機(jī)制主要是優(yōu)先化理論，保護(hù)劑優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面進(jìn)入溶液中，能在冷凍的過程中發(fā)揮保護(hù)蛋白質(zhì)的作用。干燥保護(hù)機(jī)制主要有玻璃態(tài)假說和水替代假說。玻璃態(tài)假說指在干燥過程中，由于添加了保護(hù)劑，隨著水分減少，溶液濃度逐漸增大而形成高黏度的玻璃態(tài)從而阻礙了蛋白結(jié)構(gòu)的變化。水代替假說[2]是指在干燥過程中隨著蛋白質(zhì)水化層中水分失去，保護(hù)劑代替水與蛋白質(zhì)重新形成氫鍵，從而滿足蛋白質(zhì)表面帶電基團(tuán)形成氫鍵的要求，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定。

保護(hù)劑的種類很多，主要包括糖類、多元醇類、氨基酸類、高分子類、表面活性劑等。實(shí)際工作中通常根據(jù)生物制品的凍干變性特性添加一種或多種保護(hù)劑。

2.1.1 糖類 糖類是最常見、使用最廣泛的一類凍干保護(hù)劑，是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑。在凍干各個(gè)階段均能起到一定的保護(hù)作用[3]，在預(yù)凍階段，糖類增加了蛋白質(zhì)的自由能而抑制蛋白的變性。而在干燥階段，糖類可以取代由于脫水失去的蛋白質(zhì)和水分子之間的氫鍵來穩(wěn)定蛋白質(zhì)[4]。常用的是二糖，主要包括海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘露糖等，而蔗糖和海藻糖又是最常用的二糖。

蔗糖化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，多呈無定型結(jié)構(gòu)，對于凍干過程中阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以及長期儲存中蛋白質(zhì)的伸展和聚集起到顯著作用，同時(shí)蔗糖也有一個(gè)相對較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg），使得在冷凍狀態(tài)下與蛋白質(zhì)共濃縮，起到了稀釋蛋白質(zhì)的作用，從而防止多聚體的產(chǎn)生，并且維持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。另外蔗糖上的羥基能夠替代部分結(jié)構(gòu)的水，與蛋白質(zhì)中的羰基和氨基結(jié)合形成的氫鍵使其在缺水的條件下仍然能夠保持原有的結(jié)構(gòu)，而不喪失活性[5]。Davis等[6]對蔗糖于凍干 lgG1 處方中穩(wěn)定性影響做了研究，處方中含有不同濃度的蔗糖凍干制劑復(fù)溶后其 MFI 結(jié)果表明，未加入蔗糖的處方中的亞可見顆粒含量非常高，蔗糖的添加（蔗糖:蛋白最高添加至 2:1）顯著降低了亞可見顆粒的數(shù)量，而添加少量的山梨醇（蔗糖量的 5%）進(jìn)一步降低了亞可見顆粒的水平。馮強(qiáng)等[7]對抗人肝癌單抗片段 HAb18 F(ab')2的凍干工藝研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖相對于葡萄糖、甘露醇等保護(hù)效果更佳，而且在復(fù)溶后的片段抗體在標(biāo)記率及標(biāo)記后 4 ℃放置的時(shí)間等方面均較未添加蔗糖的對照品有所增加，其原因可能是水替代假說理論。同時(shí)使用含蔗糖的抗體溶液進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，更有利于保持抗體的生物活性。在凍干制品保存過程中，凍干制品不斷吸收環(huán)境中的水，導(dǎo)致殘余含水量逐漸升高，從而使得制品的 Tg 降低，當(dāng) Tg 低于環(huán)境溫度時(shí)，可能引起生物制品變性。為了延長保存時(shí)間，可以選用蔗糖或者海藻糖作為保護(hù)劑提高制品玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。王智等[8]對載氧藥物的冷凍干燥和凍干制品的保存穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，在 P-PolyHb 溶液的冷凍干燥中，當(dāng)蔗糖/蛋白質(zhì)比率為 0.5 時(shí)得到的凍干制品 MetHb 含量為（5% ± 1.0%），但在室溫下保存 3 個(gè)月，含水量增加，MetHb 含量上升至 15%，當(dāng)蔗糖/蛋白質(zhì)比率為 1.0 時(shí)，凍干制品在室溫下保存 3 個(gè)月，含水量基本不變，MetHb 無明顯增加，其他各項(xiàng)指標(biāo)無明顯改變。因此可見，蔗糖含量的增加提高了對生物制品的保護(hù)作用。

相對于蔗糖來說，海藻糖用作保護(hù)蛋白質(zhì)效果更好，這是因?yàn)楹Ｔ逄堑牟ＡB(tài)轉(zhuǎn)化溫度相對更高，而且更不具有還原性。此外，海藻糖還有一些優(yōu)點(diǎn)：吸水性?。蛔陨矸肿觾?nèi)部不形成氫鍵而有利于與蛋白質(zhì)形成氫鍵；低的化學(xué)反應(yīng)性[9]。因此在許多藥用蛋白的冷凍干燥配方中使用海藻糖。何暉等[10]對胞內(nèi)海藻糖對紅細(xì)胞冷凍干燥保存效果影響的研究表明，孵育后的紅細(xì)胞凍干回收率隨著海藻糖濃度的增加而增加，胞內(nèi)海藻糖在凍干過程中對紅細(xì)胞有保護(hù)作用。王輝等[11]研究表明，海藻糖對凍干胸腺肽生物活性作用保護(hù)的研究中，海藻糖在規(guī)程規(guī)定的范圍內(nèi)，顯著延長了胸腺肽活性的保留時(shí)間，同時(shí)使得凍干胸腺肽熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

糖類對于蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度有關(guān)，通常在某個(gè)濃度范圍內(nèi)，糖的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大，當(dāng)達(dá)到某一濃度時(shí)，保護(hù)作用達(dá)到最大值，此時(shí)再增大糖的濃度保護(hù)效果無顯著增加。Costantino 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲基 α-D-吡喃甘露醇、乳糖、海藻糖、纖維二糖與重組人生長激素的摩爾比例為 131:1 時(shí)，均能提供最佳的保護(hù)效果，當(dāng)摩爾濃度達(dá)到 300:1 時(shí)，糖對重組人生長激素的保護(hù)作用不再提高，在某些配方中保護(hù)作用甚至有所下降。

2.1.2 多元醇類 多元醇類主要包括甘露醇和聚乙二醇等，這類物質(zhì)在凍干制劑中常作為填充劑使用，但是對生物制品凍干過程也有一定的保護(hù)作用。甘露醇具有低溫保護(hù)、容易成型以及形成的共晶物熔化溫度高（Tm= –5 ℃）等特性，常被用于凍干藥品低溫保護(hù)劑[13]。周超和李素霞[14]對重組豬胰蛋白酶凍干制劑穩(wěn)定性研究及細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究表明，3% 甘露醇是 rPT 理想的凍干保護(hù)劑，對于酶活性保留率達(dá) 81.3% ~ 101.0%，而未加保護(hù)劑的為 77%。石晶等[9]對重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子保護(hù)劑研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用 3% 右旋糖酐、1% 甘露醇、1% 聚乙二醇 4000 作為保護(hù)劑時(shí)得到的凍干制劑更為安全穩(wěn)定。其中甘露醇除了對 bFGF 蛋白質(zhì)分子非極性表面有很好的穩(wěn)定作用外，還能誘導(dǎo)蛋白亞基的自我聚合并具有減輕器壁吸附和防凍作用。聚乙二醇作為多聚物的保護(hù)劑，既有疏水性又有親水性，適合于穩(wěn)定 bFGF 類單分散狀態(tài)的非均質(zhì)蛋白質(zhì)。

2.1.3 氨基酸類 氨基酸類主要包括甘氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸等。這類物質(zhì)除了作為 pH 調(diào)節(jié)劑防止因 pH 變化導(dǎo)致變性外還有阻止處方中緩沖鹽的結(jié)晶而穩(wěn)定蛋白的作用。Mattern 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍過程中，低濃度的甘氨酸可以通過抑制 10 ~ 100 mmol 磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致 pH 值的改變而阻止蛋白質(zhì)變性。具有晶型的甘氨酸能夠提高產(chǎn)品的塌陷溫度從而保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而無定型的甘氨酸能夠阻止凍干過程中蛋白的聚集。Lale等[16]對氨基酸類在凍干過程中的保護(hù)作用進(jìn)行研究，無保護(hù)劑的過氧化氫酶在凍干過程中有 65% ~ 78% 的損失。在配方中加入氨基酸，過氧化氫酶在凍干過程中穩(wěn)定性有顯著提高，加入精氨酸和組氨酸后損失降至 10%，加入丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、4-羥基脯氨酸后，損失降至 5% 以下。

2.1.4 高分子化合物 高分子化合物中經(jīng)常被用到的凍干保護(hù)劑是血清白蛋白，它既可以作為冷凍保護(hù)劑也可以用作干燥保護(hù)劑，對蛋白的保護(hù)效果已經(jīng)得到研究的認(rèn)可。但是因其可能含有病原體，阻礙了它的應(yīng)用?，F(xiàn)在一般用重組人白蛋白代替血清白蛋白作為蛋白質(zhì)保護(hù)劑。此外，還有一些其他高分子化合物被用作保護(hù)劑，如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVA）、羥乙基纖維素、明膠等。研究表明，二糖和高分子相結(jié)合對藥用蛋白保護(hù)效果更好。例如含有二糖和羥乙基淀粉混合物的重組人白介素-11 凍干樣品和僅含二糖或羥乙基淀粉的樣品相比冷凍干燥后活性保留高[17]。

2.1.5 表面活性劑 表面活性劑對凍干過程中蛋白質(zhì)的保護(hù)作用通常被認(rèn)為是表面活性劑限制了在各種潛在的變性界面的蛋白吸附，如冰-液體、液體-空氣、瓶-液體[18]。Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)一些表面活性劑的加入，如 0.1% 和 0.5% Tween 20，能夠降低角化細(xì)胞生長因子和白介素-2 于復(fù)溶后產(chǎn)生的聚合物。而非離子表面活性劑如泊洛沙姆對于降低白介素-2 復(fù)溶后聚體產(chǎn)生沒有顯著影響。Chang 等[20]研究表明，處方中添加 0.1% Tween 80 減少了白細(xì)胞介素-1 受體拮抗劑的聚集。在處方中加入 0.02% 或 0.1% Tween 80 后同樣有效抑制了牛 IgG 的聚集。Jones 等[4]對蔗糖或 Tween 20 對 anti-L-selectin 抗體的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，處方中加入蔗糖和 Tween 20 可在復(fù)溶后明顯降低聚體產(chǎn)生，而在未加入蔗糖而僅加入 Tween 20 的處方中復(fù)溶后聚體反而增加。

2.2 優(yōu)化凍干工藝

通過優(yōu)化凍干工藝，生物類制品在凍干過程及保存期間的穩(wěn)定性同樣也能夠得到一定的改善。主要可優(yōu)化的步驟為預(yù)凍、第一步干燥、第二步干燥（解析干燥）。

2.2.1 預(yù)凍的工藝優(yōu)化——控制冰晶大小 根據(jù)生物制品的變性機(jī)制，在預(yù)凍過程中控制冰晶的大小是改善生物制品穩(wěn)定性的主要方法之一。Geidobler 等[21]通過控制冰晶大小的不同制備了牛血清白蛋白和某單克隆抗體的凍干制劑并比較其穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)通過快速冷凍即預(yù)先冷凍隔板的方法制備過程中冰晶較小，第一步干燥時(shí)間較長，同時(shí)制備的凍干粉比表面積較大。而通過控制冰晶即緩慢降溫并增加退火步驟，制備的冰晶較大，第一步干燥時(shí)間縮短，且制備的凍干粉比表面積較小。而快速冷凍的方法制品中水分殘留（0.2% ~ 0.4%）雖然小于控制冰晶的方法（0.5% ~ 0.8%），但由于兩者水分殘留都較低，對凍干制品并無本質(zhì)差異。通過控制冰晶大小的方法縮短了干燥時(shí)間，間接提高了穩(wěn)定性，且由于比表面積較大，復(fù)溶的時(shí)間也大大縮短，這兩點(diǎn)都有助于提高生物制品的穩(wěn)定性。而 Beech 等[22]用 4 種不同冷凍方法（慢速降溫、慢速降溫+ 退火、快速降溫、快速降溫+ 退火）對不同濃度的牛血清白蛋白和某單克隆抗體做出進(jìn)一步研究，通過外觀（掃描電鏡）、表面積、復(fù)溶時(shí)間等各個(gè)方面進(jìn)行了對比，其研究結(jié)果表明，低濃度的生物制品在快速降溫的方法中復(fù)溶時(shí)間明顯增加，這與其凍干后開放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和球形大孔有關(guān)。而對于高濃度生物制品其結(jié)果顯示不同冷凍方法復(fù)溶時(shí)間無顯著差異，這就說明低濃度制劑改善外觀和復(fù)溶時(shí)間可通過控制冰晶大小，優(yōu)化預(yù)凍工藝來實(shí)現(xiàn)。

2.2.2 第一步干燥——改變干燥溫度 第一步干燥是整個(gè)冷凍干燥過程中耗時(shí)最長的步驟，同時(shí)也是最復(fù)雜的步驟。其工藝受到產(chǎn)品本身性質(zhì)、溫度、壓力以及內(nèi)包材性質(zhì)等各個(gè)參數(shù)的影響。第一步干燥理想的狀態(tài)為在合理的溫度下讓其盡快升溫至平衡溫度，且盡可能地縮短平穩(wěn)溫度時(shí)間。由于其復(fù)雜性，本文不對其展開討論，僅對生物制品的特殊性進(jìn)行討論研究。

生物制品的處方中通常含有保護(hù)劑，如蔗糖或海藻糖等，這些保護(hù)劑凍結(jié)濃縮過程中具有較高的黏度。而高黏度的系統(tǒng)可以減低蛋白的變性率，這是因?yàn)槔碚撏茢嗪鸵恍?shù)據(jù)表明蛋白變性（去折疊）動力學(xué)和黏度之間存在關(guān)系，其公式為1/2= Aηα（1/2為蛋白去折疊的半衰期，A 為常數(shù)，η 為黏度，α 為耦合常數(shù)）[23]，因此在糖類系統(tǒng)中因?yàn)槠漯ざ容^大使得變性率變得很小，幾乎可以忽略，甚至在熱力學(xué)不穩(wěn)定的溫度下或高于 Tg 時(shí)干燥也不會導(dǎo)致蛋白變性。例如 65% 的蔗糖體系中，即使是在–15 ℃（高于 Tg 20 ℃）時(shí)其蛋白去折疊的半衰期為 1240 h，而干燥時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于半衰期時(shí)間。因此在糖類等保護(hù)劑系統(tǒng)中，第一步干燥溫度即使高于 Tg 也不會使蛋白發(fā)生變性。然而塌陷的情況仍然在此階段有可能發(fā)生，一般加入一定量的填充劑，如甘露醇、甘氨酸，可以避免塌陷的發(fā)生。例如當(dāng)處方中同時(shí)含有保護(hù)劑和填充劑，使得其塌陷溫度接近于共熔溫度，這樣塌陷溫度就明顯高于大多數(shù)保護(hù)劑的 Tg，這就使得在第一步干燥的過程中可以將溫度最高提升至共融溫度附近，提高干燥效率。很多研究也報(bào)告了生物制品的第一步干燥溫度可以高于 Tg 而不會導(dǎo)致其不穩(wěn)定[24-25]。

2.2.3 第二步干燥——控制升溫速率 第二步干燥是冷凍干燥的最后一個(gè)階段，由于干燥初期產(chǎn)品中水分殘留較高，通常為 5% ~ 20%，快速的升溫可能會導(dǎo)致產(chǎn)品形狀的坍塌。因此通常采用降低升溫速率的方法來控制產(chǎn)品的外形，通常以 0.1 ℃/min 或 0.15 ℃/min 為升溫速率，據(jù) Tang 和Pikal[26]研究表明，這種慢速的升溫方式是對產(chǎn)品質(zhì)量較為安全的。這一升溫速率同樣適用于生物制品。而在高溫維持一定時(shí)間以解析水分的過程中，對于溫度及干燥維持時(shí)間的設(shè)定通常會考慮生物制品的特殊性，如蛋白類藥物通常會考慮其變性溫度，將凍干機(jī)隔板溫度及干燥時(shí)間設(shè)定在蛋白不發(fā)生變性的條件下進(jìn)行。對于真空度的設(shè)定，在小于26.7 Pa 時(shí)不同的設(shè)定對于第二步干燥來說是微乎其微的，因此通常會將第二步干燥的真空度與第一步保持一致。

3 結(jié)語和展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，凍干技術(shù)在生物制藥行業(yè)的應(yīng)用越來越廣泛，應(yīng)用該技術(shù)的同時(shí)需要根據(jù)不同的生物制品特性加入一些保護(hù)劑或者是優(yōu)化凍干工藝以穩(wěn)定其制品。伴隨著凍干保護(hù)機(jī)制的研究逐步深入，凍干技術(shù)也在不斷的完善和進(jìn)步。但是對于生物制品例如蛋白的表征還需要更加深入的認(rèn)知，穩(wěn)定性機(jī)制還有待進(jìn)一步深化。而對凍干工藝過程中的某些參數(shù)，比如壓力、復(fù)溶后產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)表征和性質(zhì)是否發(fā)生改變等報(bào)道甚微，還需要更深一步的了解。盡管面對諸多問題，但是凍干技術(shù)仍是保持生物制品穩(wěn)定性的最有效方法。而開發(fā)更加優(yōu)越的凍干保護(hù)劑，提高生物產(chǎn)品的質(zhì)量是凍干技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

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田燁，Email：Reinhard0724@gmail.com

2017-11-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.015