玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定方法研究進展

曹士亮 于 滔 扈光輝 王成波 曹靖生

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所/農(nóng)業(yè)部東北北部玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150086）

玉米種子順利萌發(fā)出苗是獲得玉米高產(chǎn)的第一步，對玉米生產(chǎn)具有重要的意義。萌發(fā)期冷害是制約世界高緯度冷涼地區(qū)玉米生產(chǎn)的重要因素之一，其導(dǎo)致玉米萌發(fā)、出苗緩慢，增加病菌入侵機率，加重病害發(fā)生，造成種子霉變、腐爛，給玉米生產(chǎn)帶來嚴重的損失，是導(dǎo)致我國東北地區(qū)玉米產(chǎn)量不穩(wěn)、品質(zhì)不高的主要原因[1]。生產(chǎn)上主要采用標準發(fā)芽試驗對玉米種子的發(fā)芽率進行標定。但玉米標準發(fā)芽率是在適宜溫度下玉米出苗能力的體現(xiàn)，難以有效反映玉米在低溫不利條件下的出苗能力。隨著玉米單粒播種技術(shù)的推廣，生產(chǎn)上對玉米種子的質(zhì)量要求越來越高，選育萌發(fā)期耐冷性強的玉米品種已經(jīng)成為高緯度地區(qū)玉米育種的重要目標。準確可靠的玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定方法是有效評價玉米萌發(fā)期耐冷性、開展玉米萌發(fā)期耐冷性遺傳和育種研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。長期以來，不同學者和實驗室根據(jù)各自的試驗?zāi)康膶τ绊懹衩椎蜏孛劝l(fā)的因素進行了大量研究，形成了一系列玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的方法[2]。本文就當前玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的研究方法、評價指標和影響因素進行分析和綜述，以期為開展相關(guān)研究提供一定的參考。

1 對玉米萌發(fā)期和發(fā)芽率概念的理解

玉米種子的萌發(fā)被定義為種子的胚從相對靜止狀態(tài)變?yōu)樯砘钴S狀態(tài)，并長成幼苗的過程，這一過程一般可分為4個階段，即吸脹階段、萌動階段、發(fā)芽階段和成苗階段。我國農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程（GB/T 3543.4-1995）將發(fā)芽定義為在實驗室內(nèi)幼苗出現(xiàn)和生長達到一定階段、幼苗的主要構(gòu)造表明在田間的適宜條件下能否進一步生長成為正常的植株，即從種子到幼苗的過程；對發(fā)芽率的定義為在規(guī)定的條件和時間內(nèi)長成的正常幼苗數(shù)占供檢種子數(shù)的百分率。一些學者在研究玉米耐冷性時根據(jù)胚根突破種皮的長短來定義發(fā)芽，發(fā)芽率則定義為胚根達到一定長度的種子占供試種子的比率[2]。此外，一些學者利用胚芽鞘伸長達到一定長度作為判斷發(fā)芽的標準。如此看來，由于對玉米萌發(fā)概念理解的不同會導(dǎo)致對玉米發(fā)芽率的定義存在差異。筆者認為玉米的萌發(fā)期可以從狹義和廣義兩個范圍來理解，狹義的萌發(fā)期應(yīng)該指玉米從播種到出芽（Germination）這段時期，這里的出芽可以依據(jù)胚根突破種皮的長度來判斷，也可以依據(jù)胚芽鞘突破種皮的長度來判斷，通常這段時期也被稱為芽期（Germination Stage）；廣義的萌發(fā)期則是指從播種到出苗這段時期（Emergence Stage）。所以發(fā)芽率的概念至少應(yīng)包括3層含義，一是萌動種子的比率（以胚根長度為依據(jù)）；二是發(fā)芽種子比率（以胚芽長度為依據(jù)）；三是出苗比率（以幼苗為依據(jù)）。這些指標都是對玉米低溫條件下生長發(fā)育活力的評價，可以根據(jù)具體的試驗?zāi)康暮驮囼灄l件來進行選擇。

2 玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定方法分類

2.1 田間鑒定和室內(nèi)鑒定 玉米萌發(fā)期耐冷性的田間鑒定通常利用自然環(huán)境，通過調(diào)整播期創(chuàng)造低溫條件。在開展田間鑒定時需要掌握試驗點溫度和降水等氣象資料，合理調(diào)整和選擇播種時期，使玉米萌發(fā)能夠處于低溫條件下。在選擇不同的播種時期后，記錄出苗的時期也要相應(yīng)的發(fā)生變化。B.E.Clark[3]在對甜玉米的耐冷性進行田間鑒定時，5月播種3周后記錄出苗率，6月播種2周后記錄出苗率。盡管田間鑒定法比較接近生產(chǎn)實際，能夠客觀直接地對玉米耐冷性進行評價，但田間試驗的條件如低溫持續(xù)時間、降水量等條件不確定性較大，土壤、病原菌等情況也不盡相同，因此，田間耐冷性鑒定結(jié)果重復(fù)性差，且對于大部分高緯度地區(qū)來說，1年只能進行1次，特別是當試驗的材料較多時，需要占用大量的試驗用地，這些因素都限制了該方法的應(yīng)用。

室內(nèi)鑒定法可以通過模擬對玉米萌發(fā)不利的低溫條件，來預(yù)測玉米在田間低溫條件下萌發(fā)的表現(xiàn)[4]。最初，由于缺少室內(nèi)耐冷性鑒定試驗與田間試驗的關(guān)系的研究，玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的結(jié)果難以得到很好的解釋[3]。后續(xù)的大量研究表明，通過調(diào)整室內(nèi)鑒定的溫度、萌發(fā)基質(zhì)、水分條件、萌發(fā)時間等因素來模擬田間低溫條件，室內(nèi)萌發(fā)期的耐冷性鑒定結(jié)果與田間出苗情況的相關(guān)程度可以達到顯著水平以上，這為開展室內(nèi)玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定提供了必要的理論基礎(chǔ)[5-6]。室內(nèi)鑒定的方法不受環(huán)境因素限制，可以根據(jù)需要設(shè)定溫度及含水量等條件，重復(fù)性好，特別適合對大量的材料進行鑒定。當前，室內(nèi)鑒定已經(jīng)成為萌發(fā)期耐冷性鑒定的重要方法。北美官方種子檢測協(xié)會（AOSA，Association of Official Seed Analysts）對玉米萌發(fā)期耐冷性的鑒定就是采用室內(nèi)鑒定方法[7]。

2.2 直接鑒定和間接鑒定 根據(jù)評價指標的不同，玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定方法又可以分為直接鑒定和間接鑒定2種方法。直接鑒定法主要考查種子萌發(fā)不同時期生長發(fā)育狀況、生長量以及達到不同生長發(fā)育階段的時間，如發(fā)芽率、出苗率、根長、莖長、根莖鮮重、干重等這些可以直接觀察或者簡單測量即可獲得的指標。間接鑒定法則是對與玉米耐冷性相關(guān)的生理生化指標進行測定，如相對電導(dǎo)率、酶活性、代謝物質(zhì)含量等[8]。這些指標的測定涉及一系列的化學和物理過程，需要借助電導(dǎo)率儀、分光光度計、液相色譜等儀器設(shè)備，這些試驗過程相對于直接鑒定法較為繁瑣，耗時較長，進行大批材料鑒定時應(yīng)用起來比較困難。

3 玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的指標研究

3.1 玉米生長發(fā)育和形態(tài)指標 玉米生長發(fā)育和形態(tài)指標可以大致分為3類，第一類是規(guī)定的時間點和時間段內(nèi)達到某一生長發(fā)育階段的種子占供試種子的百分比，這些指標包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等；第二類是一定時間點或時間段玉米生物量的描述，如根長、莖長、干重、鮮重等；第三類指標是統(tǒng)計玉米達到每一生長發(fā)育階段所需要的時間，如從播種到50%發(fā)芽時間，從播種到50%出苗的時間等。

發(fā)芽率是評價玉米萌發(fā)期耐冷性最基礎(chǔ)和最重要的指標，對發(fā)芽的判斷是計算玉米發(fā)芽率的基礎(chǔ)。由于對玉米萌發(fā)各時期的判斷和理解的標準不同，導(dǎo)致研究者在對發(fā)芽的判斷上存在較大的差異。張雪峰等[9]在試驗中以胚根伸出0.6mm為發(fā)芽標準，李波等[10]在統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)時以胚根伸出0.5mm為標準，李俊明等[11]則以胚根長出2mm為標準記錄發(fā)芽數(shù)，馬延華[12]以胚根突破種皮長0.5cm作為發(fā)芽標準，E.Noli等[13]以胚芽鞘長度為2mm以上的種子來統(tǒng)計發(fā)芽率，張曉聰?shù)萚14]則以胚芽鞘長達至少1cm作為發(fā)芽的判斷標準。這些指標實際上反映了玉米種子在低溫條件下生長發(fā)育早期的萌動情況。北美官方種子檢測協(xié)會對發(fā)芽率的規(guī)定與我國種子檢驗規(guī)程的方法相類似，即統(tǒng)計正常幼苗占供試材料的百分比來評價玉米種子的萌發(fā)期耐冷性[7]。

在發(fā)芽率的基礎(chǔ)上又衍生出種子發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽指數(shù)等指標，這些指標能反映的是在規(guī)定的時間點和時間段內(nèi)萌發(fā)玉米百分比及其相對值，實際上是對低溫條件下玉米發(fā)芽能力定量的描述。低溫、高濕等不利條件對玉米生長發(fā)育速度、干物質(zhì)的合成和積累產(chǎn)生重要的影響，造成各試驗材料在同一時間內(nèi)胚根長或胚芽長、莖鮮（干）重、根鮮（干）重等方面存在著顯著的差異，這些都被用來作為耐冷性研究的評價指標[15]。

活力指數(shù)（Vi，vigor index）則綜合利用了第一類和第二類指標，公式為Vi=S×發(fā)芽率或者發(fā)芽指數(shù)，根據(jù)發(fā)芽的判斷標準不同，S可以是胚根、胚芽或者幼苗生長勢（如地上部分或根的平均鮮重或干重、胚根長或胚芽長等）。張雪峰等[9]采用的是10粒種子胚根的平均生長長度（mm）與發(fā)芽率的乘積為活力指數(shù)的指標，石海春等[16]將這個指標稱為簡易活力指數(shù)，劉春香等[6]則采用幼苗生長的平均鮮重與發(fā)芽指數(shù)的乘積來表示活力指數(shù)。

在如何選擇玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的生長發(fā)育和形態(tài)指標上目前尚未有統(tǒng)一的標準。扈光輝等[17]認為，相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率、相對苗干重、相對根干重和相對根總長適宜作為玉米芽期和苗期耐冷性鑒定指標。張雪峰等[9]認為，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)4項指標可以構(gòu)建綜合活力指標。張曉聰?shù)萚14]的研究表明，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對幼苗干重與相對活力指數(shù)呈極顯著相關(guān)，可以作為玉米自交系芽期耐冷性鑒定指標。鄭昀曄等[18]研究的相關(guān)性分析表明，相對發(fā)芽率、相對幼苗總干重、相對地上部苗干重、相對根干重之間顯著相關(guān)，是較好的耐寒性評價指標，并提出性狀相對值差異微小的自交系耐寒性強弱難以區(qū)分，采用聚類法將有關(guān)性狀綜合分析可以提供有效的借鑒。

3.2 生理生化指標 低溫會造成植物生物膜膜相的變化，增大膜的透性，降低酶活性，引起細胞生理生化過程的一些異常。當植物細胞膜被破壞后，大量電解質(zhì)外滲，對電解質(zhì)滲透率的測定是評價玉米萌發(fā)期耐冷性的一個重要指標。李霞等[19]研究表明，低溫條件下玉米吸脹期的電導(dǎo)率與常溫條件下的電導(dǎo)率的比值與發(fā)芽期耐冷性呈顯著正相關(guān)。過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）是植物組織防御系統(tǒng)中的重要保護性酶。楊靜[20]研究表明，在玉米萌發(fā)期初遇低溫時，SOD、POD、CAT 3種酶的酶活性均呈現(xiàn)出上升的趨勢。張毅等[21]也認為SOD活性下降的速率可以較好地反映出玉米耐冷性的差異。除過氧化物酶以外，丙二醛（MDA）的含量也能反映出活性氧對細胞膜系統(tǒng)造成的傷害程度，一般表現(xiàn)為耐冷性弱的自交系的MDA含量要高于耐冷性強的自交系[22]。

玉米萌發(fā)期耐冷性是一個極其復(fù)雜的性狀，它涉及一系列復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝活動和生理生化過程。與玉米生長發(fā)育和形態(tài)指標一樣，單一某一個生理生化指標往往也難以反映玉米萌發(fā)期耐冷性的強弱。近年來，廣大學者不斷嘗試在測定玉米生長發(fā)育和形態(tài)指標及生理生化指標的基礎(chǔ)上，將這些指標綜合起來分析以對玉米的萌發(fā)期耐冷性進行評價。彭云玲等[23]利用發(fā)芽期發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、根數(shù)為隸屬函數(shù)法綜合評價指標篩選出了3份強耐寒玉米自交系。

4 影響玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的主要因素

4.1 溫度 溫度是玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定首要考慮的因素。玉米是喜溫作物，對低溫非常敏感，其種子萌發(fā)、生長發(fā)育及干物質(zhì)積累一般需要較高的溫度。隨著溫度的降低玉米萌發(fā)時間逐漸延長，多數(shù)研究結(jié)論表明，玉米種子萌發(fā)所需最低溫度為5～15℃[11，24]，不同材料間萌發(fā)的最低溫度存在較大的差異。選擇的溫度過高，則不能對玉米種子發(fā)芽產(chǎn)生足夠的選擇壓，溫度過低種子則會停止生長，難以達到鑒定目的[24]。因此，在確定耐冷性鑒定的溫度時一定要根據(jù)具體的試驗?zāi)康膩磉M行選擇。當以育種為目的進行玉米耐冷性種質(zhì)資源篩選時，應(yīng)該適當采用相對較低的溫度或者設(shè)定溫度梯度逐級下調(diào)試驗的溫度。如扈光輝[24]對玉米種質(zhì)資源進行篩選和鑒定時就分別設(shè)定了20℃、11℃和7℃ 3個溫度梯度從60份穩(wěn)定系中篩選出7℃低溫條件下耐冷性強的種質(zhì)5份，為玉米耐冷性育種奠定了基礎(chǔ)。法國利馬格蘭公司玉米室內(nèi)萌發(fā)期耐冷性鑒定的方法是統(tǒng)計10℃7d～25℃3d條件下的發(fā)芽率，德國KWS公司則以5℃4d～25℃6d條件下的發(fā)芽率來評價玉米萌發(fā)期的耐冷性[6]。曹士亮等[25]最近研究發(fā)現(xiàn)，玉米5℃4d～25℃3d的發(fā)芽率分別與玉米的發(fā)芽勢和10℃21d（常用的低溫萌發(fā)處理條件）條件下的發(fā)芽率均呈顯著正相關(guān)。

4.2 水分 水分是玉米發(fā)芽的重要因素，也是影響玉米發(fā)芽的重要條件。水分通常與低溫一起造成玉米萌發(fā)期的冷害。J.K.Itabari等[26]研究表明，土壤水分含量對玉米種子萌發(fā)和出苗造成顯著的影響。孟憲新等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當土壤含水量在15%～20%范圍內(nèi)，玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)較高，適宜培育壯苗，并建議5%的土壤含水量為玉米種子萌發(fā)和苗期生長的最低預(yù)警水分。曹士亮等[25]研究發(fā)現(xiàn)，玉米種子的發(fā)芽勢在不同土壤水分含量間呈極顯著差異，品種的發(fā)芽率與土壤水分含量的互作呈極顯著差異，說明土壤水分含量對玉米種子萌發(fā)有重要的影響。北美官方種子檢測協(xié)會所制定的玉米耐冷性鑒定方法耐冷性檢測（Cold Test）和飽和耐冷性檢測（Saturated Cold Test）的差別，實際上就是依據(jù)玉米種子萌發(fā)過程中水分含量的不同，飽和耐冷性檢測通過在發(fā)芽基質(zhì)下鋪上吸水紙，保障玉米整個低溫試驗過程都在充足的水分條件下，具有相對更嚴格的逆境脅迫[7]。

4.3 發(fā)芽基質(zhì) 玉米種子發(fā)芽試驗（包括正常溫度和低溫條件）所采用的基質(zhì)對種子的萌發(fā)起到提供支持和保水的作用。隨著人們對低溫發(fā)芽規(guī)律的認識和材料技術(shù)的發(fā)展，發(fā)芽基質(zhì)也在不斷地變化。這些發(fā)芽基質(zhì)主要包括沙子、沙子草炭土混合物、滅菌土、非滅菌土、紙卷以及近年來在國外廣泛使用的發(fā)芽紙。B.E.Clark[3]研究發(fā)現(xiàn)利用非滅菌土壤的耐冷鑒定能更好地預(yù)測早期播種的出苗率。我國學者常采用在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪放濾紙或吸水紙的方法來達到持續(xù)為種子萌發(fā)提供水分的目的。張同禎等[28]比較了玉米不同發(fā)芽方法的差別，發(fā)現(xiàn)采用先鋒公司的美國安科發(fā)芽紙的紙間法，重復(fù)間差異較小，易于實現(xiàn)操作標準化和管理規(guī)范化。近年來，蛭石因其吸水、保水性好以及易于統(tǒng)一規(guī)格而被廣泛地應(yīng)用于玉米種子萌發(fā)試驗中。北美官方種子檢測協(xié)會的耐冷性鑒定主要采用蛭石為基質(zhì)[7]。本實驗室采用培養(yǎng)皿和2層3mm厚黑色海綿進行萌發(fā)試驗，可以有效解決種子低溫萌發(fā)過程中長菌的問題。

5 對玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定方法研究的展望

玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定屬于玉米種子活力檢測的范疇，是玉米種子低溫萌發(fā)能力的體現(xiàn)。無論是耐冷性遺傳育種研究，還是在生產(chǎn)上對玉米耐冷性的鑒定，都期望能夠簡單、快速地獲得準確的試驗結(jié)果。因此，好的耐冷性鑒定的方法一般應(yīng)該滿足以下幾個方面的要求。

5.1 方法簡便，鑒定周期短 玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定試驗需要設(shè)置重復(fù)，一般需要同一批次處理樣本量大。簡便的試驗方法，一方面能夠縮短鑒定時間，快速獲得試驗結(jié)果，另一方面還有利于擴大試驗的規(guī)模，例如：法國利馬格蘭公司和德國KWS公司的萌發(fā)期耐冷性鑒定試驗周期均不超過2周[6]。

5.2 試驗可重復(fù)性好 好的萌發(fā)期耐冷性鑒定方法應(yīng)該具有較好的可重復(fù)性，這樣有利于不同實驗室和不同研究人員的結(jié)果進行比較。為了實現(xiàn)試驗的可重復(fù)性，需要對試驗的條件確立作統(tǒng)一的規(guī)定。北美官方種子檢測協(xié)會所制定的玉米耐冷性檢測和飽和耐冷性檢測被多數(shù)的研究單位采用，低溫處理一般都是10℃7d，常溫的處理采用23℃和25℃不等，常溫處理時間上也存在5～7d的變化[7]。此外，在試驗的發(fā)芽基質(zhì)和發(fā)芽的水分條件上目前也沒有統(tǒng)一的規(guī)定。由于細沙、田土等發(fā)芽基質(zhì)很難統(tǒng)一規(guī)格，以一定規(guī)格蛭石為發(fā)芽基質(zhì)較容易統(tǒng)一。因此，建議以統(tǒng)一規(guī)格的蛭石為發(fā)芽基質(zhì)。

5.3 與田間低溫試驗的相關(guān)性 田間溫度、土壤水分等條件變化的不可控性限制了玉米萌發(fā)期耐冷性田間鑒定試驗的應(yīng)用，特別是隨著試驗規(guī)模的增大，試驗環(huán)境更加難以協(xié)調(diào)一致。室內(nèi)試驗可以有效地解決環(huán)境的差異，但開展室內(nèi)鑒定試驗前要選擇一些耐冷性較為明確的試驗材料確定田間試驗與室內(nèi)試驗相關(guān)性，使室內(nèi)鑒定試驗的結(jié)果更具合理性。