循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中的作用及與乳腺癌分子分型的關(guān)系

蓋希 范鳳鳳 李占文

1869年澳大利亞Ashworth[1]首次在因癌癥死亡后的患者血液中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）。目前已在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌和腎癌等多種惡性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)CTC存在，CTC被定義為自發(fā)或因診療操作引起的、由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[2]。乳腺癌已成為中國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占女性新發(fā)腫瘤的15%[3]。對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制、治療、療效以及預(yù)后評(píng)估的研究顯得尤為重要。CTC被稱為“液體活檢”工具，能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)疾病的變化，評(píng)估療效；同時(shí)由于樣本取材方便、可反復(fù)性操作、幾乎沒(méi)有創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)而逐漸被關(guān)注。CTC檢測(cè)已經(jīng)被美國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）及中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（SFDA）批準(zhǔn)，用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）預(yù)后的評(píng)估[4-5]。本文就 CTC 在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中的作用及與乳腺癌分子分型的關(guān)系作一綜述。

1CTC的檢測(cè)

大多數(shù)的實(shí)體腫瘤外周血中均可檢測(cè)到CTC，但數(shù)量稀少，幾乎是每10萬(wàn)～100萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞中只有1個(gè)CTC[6]。CTC的檢測(cè)包括富集和分離兩個(gè)系統(tǒng)：一是以

CTC細(xì)胞大小、密度、陽(yáng)性或者陰性免疫選擇為基礎(chǔ)的富集，二是以核酸、免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)及抗原測(cè)定。常用的CTC富集方法有：免疫磁珠分離法[7]、黏附分離法、膜濾過(guò)法、梯度密度離心法、OncoQuick分離法[8]以及免疫磁珠分離和膜濾過(guò)法聯(lián)合的富集方法。常用的CTC檢測(cè)方法有：免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、激光掃描技術(shù)、核酸檢測(cè)技術(shù)、差減富集技術(shù)與免疫熒光染色-染色體原位雜交的整合技術(shù)（SET-iFISH）、CTC芯片、CTC-iChip[9]、AdnaTest Cancer 癌細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)[10]以及上皮細(xì)胞免疫斑點(diǎn)法[11]。而CellSearch系統(tǒng)是將富集和檢測(cè)過(guò)程緊密結(jié)合[12]，也是唯一被FDA批準(zhǔn)可用于臨床的CTC檢測(cè)系統(tǒng)，并相繼用于MBC、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床預(yù)后評(píng)價(jià)。但由于依賴于細(xì)胞表面表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）的CTC才能用于CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，大規(guī)模的臨床應(yīng)用在目前仍然難以推廣[12-13]。

2 CTC在乳腺癌中的檢測(cè)與應(yīng)用

2.1 CTC在早期乳腺癌中的檢測(cè)與應(yīng)用 Rack等[14]在化療前對(duì)2 026例早期乳腺癌患者行CTC檢測(cè)，檢出率為21.5%（435/2 026）；李蕾等[15]對(duì)26例早期乳腺癌患者行CTC檢測(cè)，檢出率為23.1%（6/26）；說(shuō)明乳腺癌的侵襲和微轉(zhuǎn)移在疾病發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)了，乳腺癌一開(kāi)始就是一種全身性疾病。Lucci等[16]首次證實(shí)CTC對(duì)非MBC的預(yù)后評(píng)估作用，通過(guò)對(duì)302例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者進(jìn)行臨床研究，發(fā)現(xiàn)7.5ml外周血中檢測(cè)到CTC 的患者無(wú)瘤生存（disease free survival，DFS）和總生存（overall survival，OS）明顯降低，化療前檢測(cè)出的CTC數(shù)目與患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正比。Rack等[14]研究發(fā)現(xiàn)在早期乳腺癌患者中，CTC檢出率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)陰性者檢出率為19.7%（136/692），而陽(yáng)性者檢出率為22.4%（299/1 334），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但CTC檢出率與腫瘤大小、組織分級(jí)及激素受體狀態(tài)無(wú)關(guān)；并得出結(jié)論患者外周血中CTC≥5個(gè)/30ml與不良預(yù)后有關(guān)，有可能作為DFS和OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。李蕾等[15]在11例輔助治療患者中發(fā)現(xiàn)有1例檢出CTC（數(shù)目為100個(gè)/7.5ml），隨訪發(fā)現(xiàn)影像學(xué)及血清腫瘤標(biāo)志物均正常，穿刺病理證實(shí)右鎖骨下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些研究說(shuō)明CTC對(duì)早期乳腺癌患者的預(yù)后有重要的預(yù)測(cè)作用，但仍需要尋找更完善的檢測(cè)方法和統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)為臨床工作提供理論依據(jù)。

2.2 CTC在MBC中的檢測(cè)與應(yīng)用 大約40%～80%的MBC患者外周血中可檢測(cè)到CTC[15,17-18]，其中超過(guò)50%的患者CTC≥5個(gè)/7.5ml，說(shuō)明MBC腫瘤負(fù)荷大，更容易檢測(cè)出CTC，因此目前的研究大多是圍繞MBC開(kāi)展的，主要包括MBC的療效評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)。

2.2.1 CTC檢測(cè)對(duì)評(píng)估療效的作用 一直以來(lái)，CT、MRI和正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET）等影像學(xué)檢查被認(rèn)為是乳腺癌療效評(píng)估和隨訪監(jiān)測(cè)的重要方法，但是，由于對(duì)放射線損傷的顧慮和昂貴的檢查費(fèi)用，使得影像學(xué)檢查的可重復(fù)性受到限制。近年來(lái)，學(xué)者們通過(guò)對(duì)CTC的研究，發(fā)現(xiàn)其在MBC療效評(píng)估上有更大的意義。李偉等[17]應(yīng)用膜濾過(guò)結(jié)合激光掃描細(xì)胞數(shù)，對(duì)136例MBC患者每3個(gè)化療周期后行CTC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目的改變與病情的轉(zhuǎn)歸顯著相關(guān)（P＜0.01）；化療后CTC數(shù)目不變或下降的患者預(yù)后較好，而CTC數(shù)目增加的患者預(yù)后差。他們認(rèn)為CTC檢測(cè)可用于MBC化療后療效的評(píng)價(jià)。Liu等[19]進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究證明MBC患者CTC與影像學(xué)評(píng)估疾病進(jìn)展密切相關(guān)，甚至比影像學(xué)改變更早。在化療前后連續(xù)收集外周血，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC數(shù)目變化，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目在治療后3～4周出現(xiàn)改變，而影像學(xué)改變卻需要9～12周。MBC治療的目的是減輕腫瘤負(fù)荷，改善患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命，CTC檢測(cè)對(duì)MBC療效的評(píng)估具有重要的作用，可以減少無(wú)效治療對(duì)患者身體的傷害和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，是否可以取代傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查方法應(yīng)用于臨床，還需要更多的研究來(lái)印證。

2.2.2 CTC檢測(cè)對(duì)預(yù)后的評(píng)價(jià) Cristofanilli等[20]應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)MBC患者外周血中的CTC，發(fā)現(xiàn)治療前CTC是無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和OS的獨(dú)立預(yù)后因素。通過(guò)對(duì)177例MBC患者的研究發(fā)現(xiàn)，化療前CTC≥5個(gè)/7.5ml的患者較CTC＜5個(gè)/7.5ml的患者PFS（2.7個(gè)月比7個(gè)月）和OS（10.1個(gè)月比18個(gè)月）明顯縮短；同時(shí)，隨訪監(jiān)測(cè)也發(fā)現(xiàn)CTC≥5個(gè)/7.5ml也是患者預(yù)后差的一個(gè)因素。隨后的多項(xiàng)臨床研究結(jié)果均顯示CTC與MBC的預(yù)后有關(guān)，是一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因子[5,21-23]。而李偉等[17]的研究顯示CTC初次計(jì)數(shù)并不能預(yù)測(cè)患者疾病的最終轉(zhuǎn)歸，只有隨訪過(guò)程中CTC數(shù)目變化與患者預(yù)后明顯相關(guān)；另外，臨床病理因素與治療前后的CTC數(shù)目的變化均無(wú)明顯相關(guān)性。邊莉等[24]開(kāi)展的一項(xiàng)多中心、前瞻性的研究結(jié)果表明，MBC患者治療前基線CTC≥5個(gè)/7.5ml與CTC＜5個(gè)/7.5ml的患者治療3～4周PFS分別為30.4和42.0周，治療6～8周PFS分別為33.4和42.0周，不同基線水平CTC患者PFS比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。雖然這兩個(gè)研究結(jié)果與Cristofanilli等[20]稍有不同，但是治療前CTC＜5個(gè)/7.5ml的MBC患者的PFS卻明顯延長(zhǎng)，分析原因可能是由于隨訪時(shí)間過(guò)短，尚不足以反應(yīng)MBC的PFS，因此需要隨訪更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)驗(yàn)證基線水平CTC是否可以作為判斷MBC預(yù)后的指標(biāo)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的主要原因，影像學(xué)檢查方法對(duì)實(shí)體瘤的檢出有重要的意義，而對(duì)于無(wú)可測(cè)量病灶的患者影像學(xué)檢查方法的作用相對(duì)較弱。CTC檢測(cè)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病情，較影像學(xué)檢查能更準(zhǔn)確、及時(shí)地判斷病情的變化。李蕾等[15]對(duì)240例MBC患者進(jìn)行多因素分析顯示，CTC水平與骨轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），與肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及軟組織轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。

CTC檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)MBC療效和預(yù)后具有重要的作用。在臨床工作中，通過(guò)對(duì)CTC的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可及時(shí)準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，從而進(jìn)行針對(duì)性地治療，最大限度地減輕不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。

3 CTC與乳腺癌分子分型的關(guān)系

2013年St.Gallen國(guó)際乳腺癌研討會(huì)共識(shí)根據(jù)基因分析或免疫組織化學(xué)結(jié)果將乳腺癌分為4種不同亞型[25]：（1）Luminal A 型：雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）均陽(yáng)性，原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）陰性，Ki-67＜14%。（2）Luminal B 型：分為 HER-2陰性和HER-2陽(yáng)性。HER-2陰性為ER陽(yáng)性，HER-2陰性，同時(shí)滿足下列其中1條：Ki-67≥15%或PR陰性；HER-2陽(yáng)性為ER陽(yáng)性，HER-2過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增，Ki-67及PR表達(dá)水平不限。（3）HER-2過(guò)表達(dá)型。（4）基底細(xì)胞型（基底細(xì)胞表型，ER、PR和HER-2均陰性）?；准?xì)胞型乳腺癌是指具有基底細(xì)胞基因表型并不同程度地表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白和肌上皮標(biāo)記物的乳腺癌；三陰性乳腺癌（TNBC）是ER、PR與HER-2均陰性的乳腺癌。TNBC與基底細(xì)胞型乳腺癌大約有80%的重合。分子分型的提出使人們對(duì)乳腺癌重新認(rèn)識(shí)[26]，同時(shí)在治療上也有了新的突破。在傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療的基礎(chǔ)上增加了靶向治療，給HER-2過(guò)表達(dá)型患者帶來(lái)明顯的臨床獲益。

外周血中的CTC起源于原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤病灶，檢測(cè)原發(fā)腫瘤的基因表型可以指導(dǎo)臨床治療，CTC是否也像原發(fā)腫瘤一樣表達(dá)ER、PR和HER-2？王麗娟等[27]通過(guò)對(duì)53例浸潤(rùn)性乳腺癌的分子分型與CTC關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)Luminal B型和TNBC患者與Luminal A型在CTC計(jì)數(shù)上有明顯差異（均P＜0.01)。李蕾等[15]發(fā)現(xiàn)HER-2陽(yáng)性患者的CTC檢出率低于HER-2陰性患者（51.8%vs 79.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而 ER是否表達(dá)對(duì)CTC檢出率并無(wú)影響。Liu等[28]將＞30%的CTC過(guò)表達(dá)HER-2定義為CTC-HER-2陽(yáng)性，CTCHER-2陽(yáng)性率和陰性率分別為 48.1%（13/27）和100.0%（9/9）。McNemar’s檢驗(yàn)表明 CTC 的 HER-2表達(dá)情況與腫瘤組織明顯不同（P＜0.01）。目前有多項(xiàng)研究報(bào)道CTC中ER、PR和HER-2的表達(dá)情況與原發(fā)腫瘤并不一致，這可能為內(nèi)分泌和靶向治療效果不佳提供了理論依據(jù)。Pogue-Geile等[29]的NSABPB-31試驗(yàn)，通過(guò)建立預(yù)測(cè)模型分析應(yīng)用曲妥珠單抗的獲益情況，組織學(xué)HER-2陰性患者應(yīng)用曲妥珠單抗輔助治療后，達(dá)到良好的臨床獲益；而大約10%的組織學(xué)HER-2陽(yáng)性患者應(yīng)用曲妥珠單抗輔助治療卻是無(wú)效的。Agelaki等[30]應(yīng)用靶向藥物拉帕替尼能夠有效治療CTC-HER-2陽(yáng)性的MBC患者，而與原發(fā)腫瘤HER-2表達(dá)狀態(tài)無(wú)關(guān)，意味著在靶向治療過(guò)程中，監(jiān)測(cè)CTC的分子特征變化是可行的。那么，是否可以進(jìn)行組織學(xué)和CTC水平的HER-2聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)HER-2陽(yáng)性者行靶向治療的同時(shí)進(jìn)行療效的監(jiān)測(cè)，從而改善乳腺癌患者的生存，有待進(jìn)一步深入研究。

4 展望

1889年，Paget[31]提出了“種子與土壤”學(xué)說(shuō)，強(qiáng)調(diào)癌細(xì)胞與機(jī)體微環(huán)境之間的關(guān)系。CTC的異質(zhì)性轉(zhuǎn)錄使其表達(dá)不同的分子表型，表型之一的腫瘤干細(xì)胞卻具有自我生長(zhǎng)、免疫逃避、合成、耐藥以及轉(zhuǎn)移的特性，而在腫瘤的起源、發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的作用也不同，分析CTC分子表型和基因特點(diǎn)比單純檢測(cè)CTC可以提供更多的臨床預(yù)后信息[32]。最新研究顯示，近40年來(lái)＜2cm的浸潤(rùn)性乳腺癌或原位癌的發(fā)病率由36%增長(zhǎng)到68%[33]，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)有效的治療才是乳腺癌患者獲得DFS和OS的根本方法。因此提高乳腺癌檢測(cè)方法的靈敏度和制定統(tǒng)一的陽(yáng)性值標(biāo)準(zhǔn)是亟待解決的問(wèn)題。分子分型對(duì)乳腺癌的重新劃分，使TNBC成為目前治療最棘手的亞型，而其本身又是由不同亞型組成，是否可以從CTC分子特性中尋找治療TNBC的治療方法，有待進(jìn)一步深入研究。個(gè)體化治療、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)與精確的診療密不可分，相信隨著對(duì)CTC特性的深入研究和CTC檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC檢測(cè)在乳腺癌診療中將發(fā)揮更大的作用。

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