水生生物環(huán)境DNA檢測技術(shù)及其應(yīng)用

吳昀晟 ，唐永凱 ,2，李建林 ,2，劉凱 ,2，李紅霞 ,2，王欽 ，俞菊華 ,2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214128；

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫 214128）

隨著我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展，水體污染、水利工程建設(shè)、養(yǎng)殖業(yè)劇增等因素對水生生物的產(chǎn)卵場、索餌場、越冬場、洄游通道等生境帶來了許多不良的影響，導(dǎo)致了生物資源量急劇下降和生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化。為緩解這一現(xiàn)狀，目前已著手建立自然保護(hù)區(qū)、制定各項保護(hù)政策。在諸多措施實施之前，急需對水生生物資源進(jìn)行全面的調(diào)查，但水生生物隱蔽性強(qiáng)，生長形態(tài)多變，生境復(fù)雜多樣等，難以觀測鑒定，給水生生物的保護(hù)和救治帶來了巨大的困難[1-4]。傳統(tǒng)的水生生物監(jiān)測方法依靠觀測者對物種鑒定的形態(tài)學(xué)知識，通過肉眼觀測、人工計數(shù)進(jìn)行實地調(diào)查，不但調(diào)查結(jié)果不全面，而且工作量大，調(diào)查成本高[5]。拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、電捕魚等傳統(tǒng)的監(jiān)測手段有時會給水生生物或水生生態(tài)系統(tǒng)帶來一定程度上的侵入性影響[6,7]。海底拖網(wǎng)會持久影響底棲生物的棲息地，甚至傷害或殺死非目標(biāo)生物，降低海底結(jié)構(gòu)的生物多樣性[8]。保護(hù)水生生物資源及生態(tài)系統(tǒng)多樣性需要掌握不同生態(tài)系統(tǒng)多樣性的現(xiàn)狀、變化規(guī)律及趨勢，亟需一種經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確、靈敏且不損傷目標(biāo)物種的監(jiān)測方法。

近年來，環(huán)境 DNA（environmental DNA，eDNA）檢測技術(shù)發(fā)展迅速，已引入水生生物資源調(diào)查領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于入侵物種的早期監(jiān)測、瀕危物種的分布監(jiān)測、寄生蟲疾病的監(jiān)測和生物量評估等。只要生物生存在水環(huán)境中就可以檢測到它的存在，評估其相對數(shù)量。因此該技術(shù)的成熟完善有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測方法的不足，為水生生物資源調(diào)查提供新的視野與思路。

1 eDNA檢測技術(shù)

生存于環(huán)境中的生物與環(huán)境相互作用，不斷將含有自身遺傳信息的細(xì)胞組織釋放到環(huán)境中，例如排出尿液與糞便、分泌唾液、脫落毛發(fā)皮膚、受傷出血和尸體分解等[9-11]。eDNA是指從這些調(diào)查物種生存的環(huán)境樣本（如土壤、水、空氣等）中直接提取總DNA，其中包含活細(xì)胞組織的胞內(nèi)DNA和細(xì)胞組織死亡后膜降解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而釋放到環(huán)境中的胞外DNA，是不同生物完整的基因組DNA與其降解后DNA片段的混合物[12,13]。eDNA檢測技術(shù)是指利用各種檢測手段識別eDNA中關(guān)于目標(biāo)物種的信息，監(jiān)測已知生物在環(huán)境中的分布情況，探尋環(huán)境中的未知生物[14]。

水生生物eDNA檢測技術(shù)主要分為：環(huán)境水樣的采集與保存、eDNA的提取與分析及結(jié)果分析三個部分。根據(jù)目標(biāo)生物生理狀況、種群密度及水體環(huán)境，選取適當(dāng)?shù)牟蓸臃秶?、采樣水層、采樣次?shù)及重復(fù)數(shù)，有助于提高目標(biāo)生物的檢測率。Shaw等[15]指出，每個采樣點(diǎn)的重復(fù)數(shù)與檢測率有很高的相關(guān)性，重復(fù)數(shù)從2個增加到5個，檢測率明顯升高達(dá)到100%。采集的水樣應(yīng)在冷藏或冷凍保存24h內(nèi)抽濾或沉淀處理[16]。選擇適當(dāng)?shù)臑V紙（硝酸纖維膜、混合纖維膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜等），采用合理的保存方式（乙醇或冷凍等）和有效的eDNA提取方法（酚氯仿法或各種試劑盒）以最大限度地回收水樣中的eDNA[17]，更真實地反映目標(biāo)生物在環(huán)境中的存在情況。

在調(diào)查物種的目標(biāo)基因選擇上，通常傾向于線粒體、葉綠體或rRNA基因中大于500bp的DNA序列，如動物線粒體中細(xì)胞色素氧化酶I基因（COI）、植物的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因（rbcL）與成熟酶K基因（matK）、真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔基因（ITS）等[18-20]。這些基因在每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，特異性更靈敏。數(shù)字液滴PCR、實時熒光定量PCR等檢測技術(shù)的發(fā)展，促使eDNA檢測技術(shù)操作更加標(biāo)準(zhǔn)簡易，執(zhí)行更加經(jīng)濟(jì)實惠，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠[21]。

2 水生生物eDNA檢測技術(shù)的應(yīng)用

eDNA的應(yīng)用研究最早可以追溯到1987年。Ogram等[22]通過梯度離心和層析直接從海洋底泥的沉積物中獲得了大量DNA。2000年，Rondon等[23]在土壤微生物研究中首次明確提出eDNA的概念，并迅速為廣大研究者接受。2005年，Martellini等[24]從環(huán)境中采集水樣提取DNA，尋找地表水的污染源，此技術(shù)開始應(yīng)用于水生生態(tài)系統(tǒng)的研究。2008年，F(xiàn)icetola等[25]利用特異性引物擴(kuò)增水樣eDNA中的目的片段來檢測、追蹤入侵物種美國牛蛙Rana catesbeiana。eDNA技術(shù)可靠地檢測到環(huán)境中那些不能直接觀察的隱匿物種，開辟了水生生物實時監(jiān)測和保護(hù)的新視野。經(jīng)過多年的研究，eDNA技術(shù)檢測的水樣可以來源于沉積物[22]、冰川凍土[26]、河流[27]、池塘[25]、海洋[28]、人工水箱[29]等；水生環(huán)境中的監(jiān)測生物從魚類拓展到兩棲類[29]、哺乳類[30]、爬行類[31]乃至昆蟲[32]等；監(jiān)測的物種數(shù)量從單一物種到數(shù)個物種，再到同時檢測多個物種。

2.1 入侵生物的監(jiān)測應(yīng)用

外來生物或傳播疾病，或與本土生物競爭食物[33]，影響物種種類和數(shù)量，破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡，這也是造成全球生物多樣性喪失的主要原因之一。生物入侵的早期監(jiān)測是控制種群數(shù)量與入侵范圍，降低有害影響并最終消除這些生物的關(guān)鍵。但傳統(tǒng)監(jiān)測方法不但耗時耗力、且極易低估入侵程度，而eDNA檢測技術(shù)在檢測低密度生物時仍有很高的成功率和準(zhǔn)確度。2013年，Jerde等[34]用eDNA檢測技術(shù)監(jiān)測亞洲鯉入侵密歇根湖、伊利湖等北美五大湖的情況時，發(fā)現(xiàn)鳙Aristichthys nobilis和鰱Hypophthalmichthys molitrix的入侵范圍已經(jīng)超出了傳統(tǒng)監(jiān)測方法劃定的監(jiān)管區(qū)域，這表明eDNA檢測技術(shù)在入侵物種的精準(zhǔn)定位方面具有傳統(tǒng)生物調(diào)查方法無可取代的優(yōu)勢。

2.2 瀕危生物的監(jiān)測應(yīng)用

保護(hù)瀕危生物，首先需要了解該生物的棲息地分布，而eDNA檢測技術(shù)提供了一種簡易可靠的方法[35]。Rees等[36]比較了eDNA檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的調(diào)查方法調(diào)查瀕危動物冠北螈Triturus cristatus的分布。結(jié)果表明，從發(fā)現(xiàn)有冠北螈的地區(qū)采集到的水樣中檢測出含有冠北螈DNA的概率為84%，且兩者的kappa系數(shù)為0.86，eDNA檢測技術(shù)與實地調(diào)查結(jié)果完全一致，這表明eDNA檢測技術(shù)檢測瀕危物種是可靠和準(zhǔn)確的。在調(diào)查洄游性魚類的棲息地和洄游時期時，傳統(tǒng)的監(jiān)測方法非常困難，而eDNA檢測技術(shù)則可以達(dá)到這一目標(biāo)。Yamanaka等[37]利用該技術(shù)準(zhǔn)確跟蹤調(diào)查了日本花鱸Lateolabrax japonicus、鯔 Mugil cephalus、香魚 Plecoglossus altivelis 三種季節(jié)性洄游魚類的洄游路徑，豐富了魚類的洄游模式，分析了河海之間的三座人工大壩是否影響魚類棲息地的連通性。Stewart等[38]利用eDNA檢測技術(shù)監(jiān)測天鵝湖中的長江江豚Neophocaena phocaenoides asaeorientalis，發(fā)現(xiàn)深層水樣中的eDNA更能反映真實情況，而且在哺乳期、繁殖期等生殖活動頻的時期，被檢測到的eDNA的概率明顯增加。因此，eDNA不但反映水生生物的生物量，也可監(jiān)測生物的生理活動。

2.3 寄生蟲疾病的監(jiān)測應(yīng)用

水生生物的保護(hù)不僅局限于資源調(diào)查和棲息地保護(hù)，還包含繁育、檢疫、疾病防治、經(jīng)營管理等諸多方面。多數(shù)水生生物常患寄生蟲病，其中真核寄生蟲體型小，遺傳多樣性強(qiáng)，生理形態(tài)模糊，生活史復(fù)雜，宿主廣泛，難以定位并研究相關(guān)病理。Huver等[39]分析比對了eDNA技術(shù)與尸檢方法檢測吸蟲Ribeiroia ondatrae，指出eDNA檢測技術(shù)檢測寄生蟲的準(zhǔn)確性和靈敏性很高，可以檢測到低至14 fg的DNA含量，并進(jìn)一步地評估了寄生蟲的整個生命周期是否一直保持寄生狀態(tài)以及寄生蟲在適當(dāng)環(huán)境下感染其他潛在宿主的可能性。Gomes等[40]研究指出，水中原生寄生蟲Chilodonella hexasticha eDNA的水平變化與隨后魚類死亡具有高度相關(guān)性，強(qiáng)調(diào)了eDNA檢測技術(shù)在快速評估水中寄生蟲負(fù)荷、預(yù)測寄生病爆發(fā)的潛力，為水生生物疫情的預(yù)防提供了可靠的工具。但寄生蟲囊泡和卵鞘具有很強(qiáng)的物理抗性[41]，需要強(qiáng)大的力量才能破裂釋放DNA，很可能造成錯誤的評估。

2.4 生物量評估的應(yīng)用

水生生物生物量的評估一直是傳統(tǒng)調(diào)查的難點(diǎn)，特別是評估活動性強(qiáng)的水生動物。2012年，Thomsen等[28]首次嘗試?yán)胑DNA檢測技術(shù)評估海洋環(huán)境中某一物種的生物量。該技術(shù)在水生生物檢測的應(yīng)用從定性到相對定量，并開始向絕對定量拓展。Takahara等[42]在實驗室水箱和人工池塘里模擬野外環(huán)境，探索鯉數(shù)量和水中eDNA之間的關(guān)系，證明了eDNA濃度與鯉密度呈正相關(guān)關(guān)系，建立了線性方程。Pilliod等[43]同樣在野外試驗中證明了eDNA濃度與實測密度、生物量和占用斷面的比例呈正相關(guān)性。水環(huán)境中eDNA受多重因素的影響，Barnes等[29]發(fā)現(xiàn)池塘中鯉eDNA檢出濃度遵循指數(shù)衰減模式，其降解速率隨生化需氧量、葉綠素和總eDNA濃度增加而下降。Buxton等[44]比較了不同基質(zhì)對水樣中eDNA的影響，結(jié)果顯示均能檢測到冠北螈的DNA，沙子、粘土、表層土三種基質(zhì)與對照組的檢測率無顯著差異，10d后檢測率為40%～60%，15d后檢測率為10%～22%，22d后檢測率下降到非常低的水平。而Giguet-Covex等[45]發(fā)現(xiàn)在凍土沉積物中，eDNA可以保存幾百甚至幾千年。因此，為了提高eDNA評估生物量的準(zhǔn)確性，必須闡明eDNA產(chǎn)生和降解的動力學(xué)機(jī)制并量化溫度、pH、葉綠素、生化需氧量、光照強(qiáng)度、水體、微生物群體等環(huán)境因子對eDNA的影響[46]。

3 水生生物eDNA檢測技術(shù)的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

水生生物的監(jiān)測與保護(hù)是一項長期性的工作，監(jiān)測的成本、效率和有效性都至關(guān)重要。eDNA檢測技術(shù)通過制定標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用流程可以降低工作量，縮減人工成本和調(diào)查成本。在取樣過程中，只采集棲息地的環(huán)境樣品，不與目標(biāo)生物直接接觸，避免破壞本已脆弱的生境，減少對調(diào)查物種的影響，使調(diào)查無創(chuàng)傷性。傳統(tǒng)的監(jiān)測方法在某些特定的季節(jié)、天氣、環(huán)境里實施非常困難，而eDNA檢測技術(shù)受自然因素影響相對較小，這不但保證了長期調(diào)查的持續(xù)性，還拓展了調(diào)查的環(huán)境范圍；同時對兩種甚至更多的目標(biāo)生物調(diào)查并研究其分布，有助于分析物種之間的關(guān)系和群落多樣性的動態(tài)。Foote等[47]在探測海洋哺乳動物時，用靜態(tài)聲學(xué)監(jiān)測技術(shù)識別定位鼠海豚Phocoena phocoena的同時，應(yīng)用eDNA檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)了罕見的長肢領(lǐng)航鯨Globicephala melas。因此eDNA檢測技術(shù)是對傳統(tǒng)監(jiān)測調(diào)查結(jié)果的印證與補(bǔ)充而不是取代，兩者協(xié)同開展不會互相干擾。

eDNA檢測技術(shù)在應(yīng)用過程中也會遇到許多挑戰(zhàn)。Deiner等[48]指出，eDNA可以沿著河流漂流超過10km，也可以通過船舶或捕食者糞便出現(xiàn)在沒有目標(biāo)生物出沒的地區(qū)，此時選擇合理的采樣地點(diǎn)以及持續(xù)性的監(jiān)測可以有效規(guī)避此類原因所帶來的誤報。樣品在采集、運(yùn)輸和保存過程中都可能發(fā)生污染。因此在調(diào)查前必須對采樣工具、設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理；每個采樣點(diǎn)增加陰性對照即過濾蒸餾水或無目標(biāo)生物生存區(qū)域的水樣；每個采樣點(diǎn)的樣品隔離保存，防止交叉污染。在eDNA分析階段，容易產(chǎn)生假陰性或假陽性擴(kuò)增的結(jié)果。PCR引物和探針特異性低，環(huán)境中的PCR抑制劑或未充分提取eDNA都會導(dǎo)致假陰性擴(kuò)增，而引物二聚物、樣品污染則會導(dǎo)致假陽性擴(kuò)增，因此在檢測過程中必須要增加陰性和陽性對照[42,49]。

4 水生生物eDNA檢測技術(shù)的展望

隨著第二代測序技術(shù)（Next generation sequencing，NGS）的迅速發(fā)展，Pompanon 等[50]提出了一種全新的DNA條形碼-DNA宏條形碼（DNA metabarcoding），并將其運(yùn)用于水生生物監(jiān)測上。通過建立物種信息庫和DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，設(shè)計合理的通用引物對環(huán)境樣品中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和高通量測序，再從測序結(jié)果中得到的可操縱分類單元（operational taxonomic units，OTUs）進(jìn)行多個物種的鑒定。這種高效率、低成本、快速可重復(fù)的DNA條形碼技術(shù)將更適合于復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的水生生物鑒定及多樣性評估，對物種種群的單標(biāo)記分析向整個生態(tài)系統(tǒng)的宏基因組分析轉(zhuǎn)移，構(gòu)建動植物乃至微生物的物質(zhì)能量傳遞的生態(tài)系統(tǒng)圖譜，從生態(tài)系統(tǒng)水平探索生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性。

經(jīng)過十幾年的發(fā)展，eDNA檢測技術(shù)已具備了標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)流程、穩(wěn)定協(xié)同的調(diào)查過程和可靠動態(tài)的調(diào)查結(jié)果等優(yōu)勢，不僅可檢測常規(guī)的水生生物，還可以檢測入侵物種、瀕危物種、隱匿物種等。嘗試將eDNA檢測技術(shù)應(yīng)用于水生生物的群體遺傳學(xué)中，探尋群體遺傳結(jié)構(gòu)及其變化，例如應(yīng)用于譜系生物地理學(xué)，從遺傳水平上揭露水生生物保護(hù)的關(guān)鍵區(qū)域，為瀕危水生生物遷地保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。今后的水生生物資源調(diào)查研究中，在保護(hù)區(qū)深處或荒涼偏遠(yuǎn)地區(qū)建立自動取樣分析站，最大程度降低人為干擾并獲取水生生物監(jiān)測與環(huán)境數(shù)據(jù)，結(jié)合實時數(shù)據(jù)傳輸技術(shù)，建立一個生物多樣性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，調(diào)查水生生物多樣性的現(xiàn)狀、變化規(guī)律和發(fā)展趨勢。