RNAi技術(shù)在蝦免疫和生長(zhǎng)發(fā)育的研究進(jìn)展

陳田聰，呂敏，盧小花，謝達(dá)詳

（廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 530021）

蝦類種類多樣，適養(yǎng)殖品種諸多，然而蝦類養(yǎng)殖中出現(xiàn)了諸多問題，如野田村病毒、白斑病等疫病暴發(fā)，蝦類性別生長(zhǎng)差異明顯，生長(zhǎng)發(fā)育和生殖產(chǎn)生環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)，給產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大損失，必須從基因功能及調(diào)控機(jī)理上尋找新的途徑。應(yīng)用分子測(cè)序技術(shù)，不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的蝦蟹類的mRNA序列不斷被檢測(cè)出來(lái)[1]，為研究蝦類的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫蛻皮等生物學(xué)過程的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

RNAi，又稱基因敲除（Knock-down）或基因沉默（Gene silencing），指物種在進(jìn)化過程中，高度保守的同源mRNA被雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)和介導(dǎo)進(jìn)行高效特異性降解，普遍存在真核生物中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，對(duì)物種的生長(zhǎng)發(fā)育、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子和抵御異源物侵入具有重要作用。RNAi首次在反義RNA阻斷線蟲（Caenorhabditis ele-gans）的part-1基因表達(dá)時(shí)意外發(fā)現(xiàn)正義RNA能抑制part-1基因表達(dá)[2]，研究part-1基因的正義、反義和dsRNA在線蟲表達(dá)時(shí)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)dsRNA沉默特定基因表達(dá)效果最好[3]。隨后RNAi技術(shù)不斷成熟，憑借特有的高效性、穩(wěn)定性、特異性的優(yōu)點(diǎn)被科學(xué)家迅速?gòu)V泛運(yùn)用到研究基因功能上來(lái)，并取得了眾多研究成果。蝦類屬節(jié)肢動(dòng)物門，由于處在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物進(jìn)化地位之間，其生長(zhǎng)發(fā)育過程、組織構(gòu)造較為獨(dú)特，而RNAi機(jī)制普遍存在真核生物體，在調(diào)控蝦類動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程中也具有重要地位，因此，該文綜述了RNAi技術(shù)在蝦類抗病毒免疫、生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮的研究進(jìn)展，為深入解析蝦類在3個(gè)重要生物學(xué)的功能基因和RNAi技術(shù)應(yīng)用調(diào)控蝦養(yǎng)殖中面臨的棘手問題提供參考。

1 免疫

白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）和桃拉病毒（Taura syndrome virus,TSV）三種病毒類型對(duì)蝦養(yǎng)殖影響較大、危害較重、范圍較廣。研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)是動(dòng)物抵御異源有害物侵噬所形成的嚴(yán)密防御體系，根據(jù)獲得的方式分為先天性免疫和獲得性免疫，蝦類作為甲殼動(dòng)物，其自身體內(nèi)缺乏產(chǎn)生免疫球蛋白機(jī)制，幾乎不存在獲得性免疫，僅具有先天性免疫[4-5]。蝦遭受病毒侵染時(shí)，病毒基因結(jié)合至寄主的基因組內(nèi)，宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯過程中會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA，其細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer（DCR2）[6-7]與 Arsenite resistance 蛋白 2（Ars2）[8]和HIV-1反式激活應(yīng)答元件RNA結(jié)合蛋白（HIV-1transactivating response（TAR）RNA-binding protein，TRBP）[9]組成三者復(fù)合物，將產(chǎn)生的 dsRNA 分割成與宿主細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Argonautes 2（A－go2）結(jié)合組成沉默復(fù)合物的siRNA，切割降解病毒的mRNA，抑制病毒基因的表達(dá)和復(fù)制，抵御病毒感染[10]。在蝦類動(dòng)物中，RNAi技術(shù)應(yīng)用伊始是在免疫方面。Kim等人首次將綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、鯰（Ictalurus punctatus）和野豬（Sus scrofa）3種脊椎動(dòng)物的免疫球蛋白基因dsRNA注射入感染W(wǎng)SSV和YHV的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)注射異源物種dsRNA后病死率下降，結(jié)果表明，蝦類作為無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏免疫球蛋白基因，所注射的3種脊椎動(dòng)物的免疫球蛋白基因dsRNA不可能參與該蝦抗病毒免疫系統(tǒng)，3種外源性dsRNA通過激活其先天性免疫機(jī)制起到抗病毒作用是減少凡納濱對(duì)蝦死亡的原因[11]。

1.1 WSSV

3種類型病毒中危害最嚴(yán)重的是WSSV，給國(guó)內(nèi)外蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成的損失不可計(jì)數(shù)。WSSV是一種雙層囊膜狀桿狀型雙鏈病毒，VP19、VP24、VP26、VP28等10余種膜蛋白迄今已被發(fā)現(xiàn)[12-13]，WSSV病毒粒子的吸附、入侵、包裝和釋放等關(guān)鍵過程通常涉及到這些膜蛋白，可應(yīng)用RNAi技術(shù)定向沉默編碼這些病毒蛋白質(zhì)mRNA抑制其拷貝[14-15]。將攜帶WSSV的中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）注射VP28和VP281的長(zhǎng)鏈dsRNA[16]、WSSV的日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）注射VP28的短鏈dsRNA、WSSV的凡納濱對(duì)蝦注射VP28的dsRNA，病死率大大減少[17-18]。斑節(jié)對(duì)蝦的Rab7可以與WSSV的VP28結(jié)合，在WSSV感染機(jī)制中發(fā)揮作用[19]。

1.2 TSV和YHV

TSV和YHV與WSSV不同，是單鏈RNA病毒[20-21]，對(duì)于YHV，RNAi僅限于體外細(xì)胞中研究其gp116和gp64，對(duì)于YHV和TSV，諸多研究成果集中在阻斷傳輸通路中的相關(guān)基因[22]。Rab7蛋白是研究RNAi干擾兩種病毒常用蛋白，屬于GTP結(jié)合蛋白家族Rab家族成員，病原體入侵宿主細(xì)胞后，被宿主Rab7蛋白特異識(shí)別結(jié)合，避開溶酶體的消化，不能介導(dǎo)晚期胞內(nèi)體與溶酶體的膜融合，溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)過程受阻，導(dǎo)致宿主感染[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，TSV、YHV感染的斑節(jié)對(duì)蝦注射Rab7的dsRNA，Rab7基因的表達(dá)量大大降低，病毒感染被有效抑制，另外，WSSV感染的斑節(jié)對(duì)蝦注射Rab7的dsRNA，也有類似結(jié)果，推測(cè)Rab7蛋白可能參加了病毒復(fù)制過程中的內(nèi)吞運(yùn)輸[23-24]。

RNAi作為一種完全、高效、無(wú)毒的抗病毒入侵的新技術(shù)，在蝦類動(dòng)物抗病毒方面彰顯了重要作用，研究進(jìn)展不斷取得突破，研究層次不斷深入到感染信號(hào)通路的調(diào)控和特定病毒基因表達(dá)的沉默，對(duì)控制病原體感染尤為重要。雖然RNAi干擾病毒感染過程的理論不斷豐富，但開發(fā)和構(gòu)建特定病毒長(zhǎng)期性表達(dá)的特異RNAi體系，并應(yīng)用到蝦類動(dòng)物養(yǎng)殖中是當(dāng)前重要研究方向。

2 生長(zhǎng)發(fā)育

RNAi作為現(xiàn)代分子生物技術(shù)，在甲殼類動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育方面有著廣泛應(yīng)用，近來(lái)也在研究蝦類動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不斷取得顯著成果[25-26]。一般生物生長(zhǎng)發(fā)育包括正常的細(xì)胞增殖、組織生長(zhǎng)、增重等生理現(xiàn)象。該文主要闡述了RNAi對(duì)蝦體內(nèi)的肌肉生成抑制素（Myostatin，MSTN）、表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR）、Hox基因（Omeobox genes）的作用。

MSTN、EGFR、Hox三種基因在蝦類動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育上具有重要地位，是其體質(zhì)量增加、個(gè)體生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。MSTN是控制肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控因子，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Ttransforming growth factor-β，TGF-β）家族一員，又稱生長(zhǎng)分化因子（Growth differentiationfactor 11，GDF-11）[27]。有研究稱，日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense）的 MSTN/GDF-11基因在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)量不同，早期階段表達(dá)豐度高，隨后表達(dá)量降低，結(jié)果表明，MSTN/GDF-11基因參加了該蝦生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)過程[29]。對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦MSTN/GDF-11基因RNAi干擾結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長(zhǎng)期（斑節(jié)對(duì)蝦45 d、凡納濱對(duì)蝦56 d）干擾后，干擾組增重均大大低于對(duì)照組，且凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)較高的病死率（71%）[30-31]?？傮w來(lái)看，MSTN/GDF-11是促進(jìn)蝦類動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的基因。EGFR是一種跨膜蛋白分子，具有酪氨酸激酶功能，通過結(jié)合配體誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路依次激活，促進(jìn)機(jī)體控制生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖。對(duì)干擾羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）Mr-EGFR基因的研究結(jié)果表明，經(jīng)13周之后，干擾實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)變緩，體質(zhì)量大大低于對(duì)照組，Mr-EGFR是調(diào)控該蝦生長(zhǎng)發(fā)育重要因子[32]。Hox基因（Omeobox genes）是節(jié)肢動(dòng)物軀體生長(zhǎng)發(fā)育的重要引進(jìn)，表達(dá)時(shí)遵守嚴(yán)格的胚胎發(fā)育的程序性、組織特異性，同源異型盒主要有 3 種：Ultrabithorax(Ubx)、Distal-less(Dll)、Spalt[33]。Spalt基因發(fā)現(xiàn)于鹵蟲體內(nèi)，Dll基因發(fā)現(xiàn)于水蚤，兩類基因在蝦類研究較少[34]。對(duì)通過干擾明鉤蝦（Parhyale hawaiensis）附肢的生長(zhǎng)發(fā)育Ubx基因研究發(fā)現(xiàn)，干擾后，Ubx、Dll基因表達(dá)量減少，附肢表型發(fā)生變化[35]，表明Ubx可能是參與了明鉤蝦附肢的發(fā)育過程。

機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)涉及多個(gè)基因和調(diào)控信號(hào)通路的復(fù)雜有序的生物學(xué)過程。目前，雖然RNA干擾蝦類動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制取得一定研究成果，但與其他甲殼類相比，特別是陸生類，RNAi技術(shù)應(yīng)用依然需要很長(zhǎng)的路要走。生長(zhǎng)發(fā)育作為蝦類最基本的生物發(fā)育過程，更多的生長(zhǎng)發(fā)育基因需要挖掘，諸多的信號(hào)通路機(jī)制需要搞清，而RNAi和其他分子技術(shù)在此研究過程中是必不可少的輔助技術(shù)。

3 蛻皮

蝦類屬于水生甲殼動(dòng)物，其身體組織和構(gòu)造獨(dú)特，與其他水生動(dòng)物、陸地甲殼類動(dòng)物相比，蛻皮現(xiàn)象也比較特殊，目前主要發(fā)現(xiàn)六種蛻皮因子：甲基法尼酯（Methyl farnesoate，MF）、蛻皮抑制激素（Molt Inhibiting Hormone，MIH）、蛻皮激素（Ecdysteroids，E）、蛻皮激素受體（Ecdysone receptor，EcR）、維甲酸X 受體（Retinoid X receptor，RXR）、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛻殼響應(yīng)基因E75和幾丁質(zhì)酶[36-37]。對(duì)用dsRNA沉默紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）Cq-MIH 基因、干擾日本沼蝦的Mn-MIH基因的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾后，相比對(duì)照組，蛻皮周期加快，蛻皮頻次增加，MIH是蝦類動(dòng)物蛻皮周期中的負(fù)調(diào)控因子[38-39]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，EcR正調(diào)控MIH基因的表達(dá)，是MIH基因上游調(diào)控因子，RNAi研究證實(shí)，蝦類動(dòng)物的蛻皮機(jī)制與其他甲殼類相似，一般通過“E→EcR→MIH”信號(hào)通路機(jī)制調(diào)控蛻皮[40]。RXR是甲殼類動(dòng)物蛻皮重要調(diào)控因子，RXR與EcR結(jié)合成二聚體結(jié)構(gòu)形式，調(diào)控下游E75基因的表達(dá)水平[41]。注射dsRNA對(duì)中國(guó)對(duì)蝦幼蝦體內(nèi)RXR的干擾后，下游Chi、Chi-1幾丁質(zhì)酶基因及E75基因的表達(dá)水平降低，推斷RXR是參加了蝦類蛻皮信號(hào)通路的基因[42]。通過持續(xù)注射E75-dsRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國(guó)對(duì)蝦的蛻皮受阻，表明E75基因作為必需基因參與了蝦類動(dòng)物蛻皮調(diào)控[43]。用RXR、EcR和E75基因的dsRNA干擾凡納濱對(duì)蝦，沉默任意一個(gè)基因，會(huì)誘發(fā)其他兩個(gè)基因的表達(dá)豐度均發(fā)生改變，蛻皮通路和與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因受到影響，進(jìn)一步證實(shí)了RXR、E－cR和E75基因是調(diào)控蝦類動(dòng)物蛻皮過程的必需基因[44]。MF是蝦體內(nèi)一種承擔(dān)調(diào)節(jié)體節(jié)發(fā)育、生長(zhǎng)和生殖的重要生長(zhǎng)調(diào)控因子，MF的生成主要通過甲基法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Farnesoicacid O-methyltransferase，F(xiàn)AMeT）催化法尼酸轉(zhuǎn)化而成[45-46]。對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射FAMeT基因的dsRNA，F(xiàn)AMeT降低了表達(dá)量，蛻皮時(shí)間延遲，與蛻皮相關(guān)的組織蛋白酶、血藍(lán)蛋白的基因表達(dá)水平下調(diào)，實(shí)驗(yàn)組因蛻皮阻滯全部死亡，對(duì)照組則未發(fā)現(xiàn)死亡，結(jié)果表明，F(xiàn)AMeT基因是蝦類動(dòng)物生長(zhǎng)、蛻皮的重要信號(hào)因子[47]。

蛻皮是蝦類動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的標(biāo)志性特征，是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)雜的生物學(xué)過程。它貫穿于甲殼動(dòng)物個(gè)體發(fā)育的始終，受MIH信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路以及NO信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)[48]。目前對(duì)蛻皮機(jī)制的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)有限，各信號(hào)通路直接是否存在關(guān)聯(lián)，以及每條信號(hào)通路都存在哪些具體的調(diào)控因子，這些都需要進(jìn)一步研究。

4 展望

RNAi技術(shù)與 TALEN、ZFN、CRISPR/Cas9h等基因組編輯技術(shù)作為現(xiàn)代研究基因功能的輔助分子工具，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物?；蚪M編輯技術(shù)主要借助顯微注射技術(shù)對(duì)細(xì)胞系或者胚胎基因組DNA進(jìn)行操作。截至目前，由于蝦作為甲殼動(dòng)物，其卵殼較硬易碎，且相應(yīng)的成熟細(xì)胞系構(gòu)建體系缺乏。因此，運(yùn)用基因組編輯技術(shù)挖掘蝦類基因功能的相關(guān)文章鮮有報(bào)道。未來(lái)基因組編輯技術(shù)是基因功能挖掘的發(fā)展趨勢(shì)，目前來(lái)說(shuō)，在技術(shù)成熟和功能上，RNAi技術(shù)更完善，優(yōu)勢(shì)更顯著。盡管RNAi操作過程中會(huì)出現(xiàn)脫靶和效應(yīng)劑量等的問題，然而，可以通過篩選找出最佳靶點(diǎn)和合適劑量的dsRNA。與脊椎動(dòng)物、其他類甲殼類動(dòng)物相比，蝦類由于體型較小，所需dsRNA注射用量較少，現(xiàn)有開發(fā)出的RNAi試劑盒可以滿足實(shí)際科研實(shí)驗(yàn)要求，并且可節(jié)約成本。另外，人工合成的dsRNA可持續(xù)在生物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的優(yōu)點(diǎn)。研究結(jié)果表明，人工合成的斑節(jié)對(duì)蝦體GIH-dsRNA在其體內(nèi)的有效作用時(shí)間可達(dá)30 d以上[49]。注射法是研究RNAi機(jī)制的主要轉(zhuǎn)染方法。最近報(bào)道了鹵蟲飼喂法，用鹵蟲濾食富集斑節(jié)對(duì)蝦GIH-dsRNA的大腸桿菌，將該鹵蟲作為餌料投喂斑節(jié)對(duì)蝦，可引起GIH基因的表達(dá)豐度降低[50]，該方法簡(jiǎn)單方便有效，特別是對(duì)不適用注射法的蝦類幼體而言，為應(yīng)用RNAi技術(shù)挖掘幼體發(fā)育時(shí)期的功能基因提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

RNAi是生物機(jī)體內(nèi)生的抗病毒免疫機(jī)制，在抵御病毒浸染中具有重要作用，然而，目前其在蝦類動(dòng)物免疫生理過程中的具體分子機(jī)制尚未完全搞清。經(jīng)病毒誘導(dǎo)的昆蟲、蟹類可在自身體內(nèi)獨(dú)立生成抗病毒的siRNA和miRNA，且各自免疫功能特異[51-53]。由于蝦類特殊的生境形成了自身特有的組織構(gòu)造和功能基因，其獨(dú)有的siRNA和miRNA是獨(dú)立作用機(jī)制還是協(xié)同機(jī)制以及具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。借助RNAi技術(shù)搞清危害蝦類養(yǎng)殖中病毒性疾病的發(fā)病原理，尋找出科學(xué)合理的防治方法和高效藥物，促進(jìn)蝦類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。蝦類動(dòng)物的各個(gè)生物學(xué)過程相互依存，相互關(guān)聯(lián)。甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育與蛻皮現(xiàn)象相輔相成，生長(zhǎng)發(fā)育導(dǎo)致了蛻皮現(xiàn)象，蛻皮也是生長(zhǎng)發(fā)育的必經(jīng)環(huán)節(jié)，促進(jìn)了機(jī)體的生長(zhǎng)。蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)育之間基因信號(hào)通路各異卻又相互連接，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，在探索基因組方向上，需要從挖掘單個(gè)基因或幾個(gè)基因的功能轉(zhuǎn)變到基因信號(hào)通路。基因測(cè)序技術(shù)挖掘了大量的基因信息，而RNAi通過精確定位沉默目的基因研究下游基因的表達(dá)量變化，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平上研究和解讀其信號(hào)通路。

綜上所述，RNAi作為一種應(yīng)用廣泛、快速發(fā)展的現(xiàn)代分子技術(shù)，在蟹、節(jié)肢昆蟲研究中已經(jīng)展示了廣闊應(yīng)用前景。蝦作為主要經(jīng)濟(jì)類水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，隨著對(duì)其RNAi信號(hào)通路機(jī)制的研究不斷深入，基因功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不斷被解讀，不僅推動(dòng)其基因組學(xué)的發(fā)展，也將為養(yǎng)殖技術(shù)和應(yīng)用提供厚實(shí)的理論支撐，推動(dòng)該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。