外周血microRNA與肺癌

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(1.湖南師范大學附屬張家界醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2.湖南師范大學附屬第一醫(yī)院；3.武漢大學中南醫(yī)院)

1 MicroRNA概述

人類基因組包括20 805個編碼基因和37 147個非編碼基因及假基因，通過RNA加工與編輯可形成196 501個基因轉(zhuǎn)錄本，RNA在人類基因組中扮演著重要角色。其中微小RNA (microRNA)分子長度很短，通常存在于外周血中,被包裹于外核體、微粒和凋亡小體中，參與囊內(nèi)運輸，部分microRNA存在于脂蛋白等復合物中參與囊外運輸。雖然血液中存在大量的核糖核酸酶，但是外周血中microRNA相當穩(wěn)定，通過不同的極端條件(如高溫、延長保存期、反復凍融等) 處理microRNA，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性并沒有明顯改變，表明microRNA具有很強的抗RNase A水解能力，其穩(wěn)定性有助于功能的發(fā)揮。

MicroRNA可同時調(diào)節(jié)多個基因或參與多條途徑從而影響整個生物過程網(wǎng)絡而發(fā)揮其獨特功能。自從首次報道癌癥中有microRNA異常表達以來，microRNA就被認為是腫瘤發(fā)病機制的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是新型臨床干預的標志物。隨著我國工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染逐漸加重、人口老齡化結(jié)構(gòu)日趨明顯，肺癌的發(fā)病率、病死率均呈上升態(tài)勢，嚴重危害著人們的健康。然而,由于肺癌早期一般無明顯癥狀,一旦確診大部分已是中晚期，肺癌患者預后極差。因此,尋找早期診斷和早期治療的方法和手段迫在眉睫。而通過生物分子方面的研究以尋找更有效的早期診斷方法，靶向治療肺癌，是目前國內(nèi)外的研究熱點。近年來一些研究顯示microRNA可用于肺癌的早期診斷及治療[1]，提高肺癌患者生存率。 本文將總結(jié)概括microRNA在肺癌領域發(fā)揮的作用，以及它在臨床應用中的潛力。

2 MicroRNA與肺癌的發(fā)生發(fā)展

目前肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，是機體在各種致瘤因子的作用下，局部組織細胞在基因水平上失去了正常調(diào)控，導致單克隆性異常增生而形成的新生物。研究表明microRNA與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。MicroRNA通常位于染色體區(qū)域的“脆弱點”以及與腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域，可通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達，影響細胞的增值、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學行為，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。

2.1 MicroRNA基因在肺癌中的致癌作用在腫瘤中呈高表達的microRNA基因被認為是癌基因，它們通過抑制抑癌基因的活性，促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多順反子miR-17～92簇是microRNA中具有原癌基因作用的代表，在多種類型的惡性腫瘤中高表達，包括肺癌、彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤等。Takahashi團隊首次發(fā)現(xiàn)了microRNA與肺癌的關(guān)系，他們的研究顯示在肺癌細胞中，miR-17～92簇顯著過度表達，促進肺癌細胞增殖生長。另外有研究顯示miR-17～92可通過下調(diào)RAB14從而阻止肺部對外部致癌物的作用，從而導致肺癌的發(fā)生。miR-21基因是研究較多的另一種具有原癌基因作用的microRNA，下調(diào)miR-21 的表達可以抑制肺癌干細胞的增殖和侵襲能力[3]。MiR-21水平與磷酸化EGFR水平相關(guān)，并被EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)抑制，反義miR-21增強EGFR-TKI誘導的細胞凋亡，促進非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的細胞生長和侵襲。Jiang等[4]研究證實miR-21可阻止程序性細胞死亡4的表達而激活PI3K/AKT/mTOR 通道，促進NSCLC的生長。另外，Wang等[5]研究顯示在NSCLC細胞系中重新導入miR-575，可顯著促進細胞增殖，提高癌細胞遷移和侵襲的能力。另有研究結(jié)果表明miR-27a的過度表達可通過抑制原代人支氣管上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化的靶基因FBXW7來促進細胞生長?？傊琺icroRNA中有多種基因可通過影響細胞增殖、生長及凋亡等過程，從而有助于癌癥的發(fā)生與發(fā)展。

2.2 MicroRNA基因在肺癌中的抑癌作用microRNA家族中部分基因的抑癌作用也是其重要功能之一。其中l(wèi)et-7可以負調(diào)控細胞周期進程和終末細胞分化起抑制作用，與鄰近的正常肺組織相比，在肺癌組織中，let-7家族表達明顯下調(diào)，患者總生存期減少。近年的數(shù)據(jù)[6]顯示let-7可聯(lián)合miR-34協(xié)同抑制非小細胞肺癌細胞增殖來抑制腫瘤的發(fā)生與生長。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)43%的NSCLC樣本中miR-34b / c的表達顯著降低，miR-34的恢復可抑制肺癌細胞的生長。而肺組織是miR-449優(yōu)先表達的位點，與相應的正常組織相比，R-449a / b的異位表達降低了多種肺癌細胞系中的細胞活力而起腫瘤抑制作用，因此，miR-34/449家族在肺癌中起抑制腫瘤作用。miR-125b的表達可能通過抑制抗凋亡分子Mcl-1或Bcl-w誘導來源于肺癌的各種細胞系和致敏的癌細胞對不同凋亡刺激的自發(fā)性凋亡，表明miR-125b的上調(diào)可抑制腫瘤的發(fā)展。MiR-183家族成員(miR-183，miR-182和miR-96)具有共同和獨特的靶標，所有這三個成員可抑制調(diào)節(jié)癌癥中鋅穩(wěn)態(tài)的鋅轉(zhuǎn)運蛋白，從而抑制肺腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，然而zhang等人[7]的研究顯示miR-183可促進非小細胞肺癌的生長，但是其具體作用機制及家族其他成員的作用尚未完全明確。因此microRNA中抑癌基因的作用非常復雜，尚需進一步的實驗來證實。

2.3 microRNA調(diào)節(jié)肺癌血管的形成隨著腫瘤的增長，瘤體中心與原血管之間的距離變得越來越大，其中心易出現(xiàn)缺氧。缺氧是腫瘤發(fā)生的主要標志，它調(diào)節(jié)著缺氧誘導因子1(HIF-1)的活性，而HIF-1-α誘導血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)等不同血管生長因子的表達，作用于各自的受體，促進新的毛細血管形成。艾麗菲熱·買買提等[8]綜述顯示miR-126、miR-15a 、miR-16、miRNA-128、miR-20a、miR-20、miR-93、miR-15b等miRNA 通過直接或間接作用于VEGF及其信號通路而影響血管新生的進程。越來越多的證據(jù)也表明，microRNA是肺癌血管生成以及缺氧反應的重要調(diào)節(jié)因子。在NSCLC細胞中miR-126的表達直接導致VEGF-A下調(diào)，從而影響腫瘤中新生血管的形成，而miR-519c的過表達會導致HIF-1-α的顯著降低和肺癌血管生成的減少。此外，在肺癌血管生成過程中還受成纖維細胞生長因子(FGF)和白細胞介素-8(IL-8)等細胞因子的作用，而這些細胞因子又受microRNA的調(diào)節(jié)。在NSCLC患者的腫瘤樣本中，通過miR-200的調(diào)控，IL-8水平升高，而且miR-200可以靶向腫瘤的內(nèi)皮細胞和生長調(diào)節(jié)蛋白細胞，影響肺癌血管的生長。相反，miR-378的過度表達增強了IL-8的表達，因此增加了NSCLC患者內(nèi)皮細胞的刺激[9]，促進細胞生長。還有其他與血管生成有關(guān)的蛋白質(zhì)也受到microRNA的調(diào)控，例如，異常表達的miR-381可在mRNA和蛋白質(zhì)水平均可抑制干細胞基因ID1的表達，參與腫瘤侵襲和血管生成，并因此顯著降低肺癌細胞的遷移和侵襲能力。

此外，異常表達的microRNA亦與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，最新的一項研究提示[10]miR-200家族和miR-183-96-182集群通過靶向作用于Foxf2抑制肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，microRNA不但可以發(fā)揮癌基因和抑癌基因的直接作用，還能通過調(diào)節(jié)肺癌血管的生成、影響肺癌的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮作用。

3 MicroRNA在肺癌中的臨床運用

microRNA與肺癌發(fā)生、發(fā)展的交織網(wǎng)絡暗示microRNA參與肺癌發(fā)病機制的多個環(huán)節(jié)，靶向microRNA是干預肺癌的新方法，包括診斷、治療和結(jié)果預測。

3.1 MicroRNA用于肺癌的早期診斷早期診斷是肺癌治療的關(guān)鍵。癌胚抗原、糖類抗原、蛋白和酶類是肺癌診斷常用的腫瘤標志物，但其敏感性和特異性均不高，發(fā)現(xiàn)新的早期診斷標志物十分重要。近年來一項新的檢測技術(shù)——液體活檢問世，為肺癌的精準診斷帶來了新希望。這項新技術(shù)主要通過檢測體液中來源于腫瘤的循環(huán)腫瘤抗體譜、microRNA、循環(huán)腫瘤DNA和外泌體等生物標志物來反應與肺癌有關(guān)的情況，為肺癌的早期診斷提供一種無創(chuàng)、簡潔、快速的手段。其中液體活檢的主要項目就是外周血microRNA。外周血microRNA與腫瘤組織microRNA具有一定的相關(guān)性，多數(shù)異常表達的microRNA在組織和外周血中有相同的變化趨勢[11]。外周血microRNA非常穩(wěn)定，能夠抵抗核糖核酸酶的降解，且在體內(nèi)生存期長，經(jīng)室溫過夜、煮沸、反復凍融、過酸處理，仍十分穩(wěn)定。因此，通過液體活檢檢測外周血中microRNA的表達將可能成為診斷肺癌的重要標志物，并且比傳統(tǒng)的病理活檢手段更具有優(yōu)勢。Vosa等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中, miR-21, miR-210, miR-182, miR-31, miR-205, miR-183表達上調(diào)，miR-126-3p, miR-30a, miR-30d, miR-486-5p, miR-451a, miR-126-5p, miR-143, miR-145表達下調(diào)。 Cui等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b表達水平的升高與肺癌患者的生存率降低有關(guān)。檢測這些microRNA有助于肺癌的早期診斷。

目前檢測microRNA的常用技術(shù)有實時熒光定量PCR、Northern blot法、原位雜交技術(shù)、基因芯片、電化學傳感儀、Sanger 測序、基因敲除和過表達等，目前運用最多和最成熟的是PCR。Tang等[14]運用Q-PCR分析法，結(jié)果顯示與健康對照組相比，在血漿中miR-21和miR-155表達水平升高，而miR-145在肺癌患者中表達水平較低，結(jié)合檢測這三種microRNA有助于區(qū)分肺癌和健康吸煙者，其靈敏度為69.4%，特異性為78.3%。另一項研究顯示[15]，運用Q-PCR分析法檢測microRNA，與健康人相比，miR-125a-5p,miR-25和miR-126在肺癌患者血清中顯著減低，聯(lián)合檢測這三種microRNA，能以87.5%的靈敏度和特異性區(qū)分早期肺癌患者。以上證據(jù)提示部分microRNA有可能成為肺癌早期診斷的新型無創(chuàng)性生物標志物。

3.2 MicroRNA用于肺癌的治療隨著免疫學、基因組學等學科的發(fā)展，探索有效治療肺癌的新方法是目前基礎研究領域的當務之急。MicroRNA作為一類控制中心基因表達的調(diào)控因子，作為生物治療腫瘤的目標分子比基因編碼更加有效，可利用microRNA的三種機制進行抗腫瘤治療，減緩腫瘤的生長和播散，包括：(1)恢復腫瘤抑癌基因microRNA的表達；(2)滅活原癌基因的致癌活性；(3)調(diào)節(jié)microRNA的基因調(diào)控網(wǎng)絡，恢復腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

一些具有抑癌基因功能的microRNA在肺癌患者中呈低表達或抑制，可以采用基因轉(zhuǎn)染的方式導入并激活相應microRNA的表達，從而達到潛在的治療作用[16]。例如在肺癌動物模型中引入合成的let-7可以減小瘤體大小，體外組織培養(yǎng)也證明在人的肺癌細胞中導入let-7可以抑制細胞增殖。miR-93、miR-98、miR-197 通過下調(diào)抑癌基因FUS1 的表達而起到抑制肺癌生長，且與肺癌患者總體生存率密切相關(guān)。研究表明小鼠及人類肺癌中miR-34c,miR-145和miR-142-5p表達受抑制，通過進行轉(zhuǎn)染可以顯著抑制肺癌細胞的生長，發(fā)揮抗腫瘤效應。microRNA具有較低的毒性，并且能夠“多靶向”，表明它們有潛力進入臨床實踐。 一方面通過增加microRNA中抑癌基因的表達，另一方面則通過抑制或者減少microRNA中致癌基因的表達，起到抗肺癌的作用[17]。如miR-145 可以通過下調(diào)c-myc 的表達來抑制肺癌細胞增殖，miR-let-7a 通過抑制KRAS 和c-myc 的表達來抑制以裸鼠為模型的肺癌細胞的生長，進一步深入研究microRNA中各種基因有望成為肺癌基因治療的新靶點。

另外，對化療或放射治療的耐藥性是當前肺癌治療的一個障礙，而部分microRNA可改變肺癌細胞對不同藥物或輻射的反應。在人類肺腺癌中低表達的miR-100通過絲/蘇氨酸激酶信號通路,引起PLK1的高表達，導致肺腺癌細胞對多稀紫杉醇耐受，而高表達的miR-100可以恢復耐藥細胞株對多稀紫杉醇的敏感性。Cortez等[18]研究顯示microRNA-200c的過表達可通過直接調(diào)控氧化應激反應基因,抑制DNA雙鏈斷裂修復，提高活性氧水平，上調(diào)p21，增加肺癌細胞放射敏感性，從而發(fā)揮治療潛力。雖然利用以上轉(zhuǎn)染技術(shù)有望成為治療肺癌的新靶點，但把microRNA 運用到臨床治療肺癌還有很多困難需要克服，包括microRNA藥物的穩(wěn)定性，在體內(nèi)的傳遞、吸收及組織的特異性等?？傮w而言，基于microRNA的療法仍處于初級階段，但運用于臨床仍是有潛力、有希望的。

3.3 MicroRNA用于判斷肺癌的預后目前，肺癌的死亡率高，尋求判斷肺癌預后的生物學標志物至關(guān)重要。研究表明，microRNA在腫瘤組織中有著不同的表達譜，通過檢測腫瘤組織microRNA的表達譜，可以判斷腫瘤的存在及生長情況，以便確定肺癌患者的預后。最新一項研究[19]表明miR-150在NSCLC中高表達，miR-150的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床TNA分期有關(guān)，分析顯示在miR-150高表達患者中累積5年總生存率為40.8%，而在低表達組為69.2%。呂秀等[20]的研究顯示血漿miR-4731-3p 在肺癌血漿中表達上調(diào)，可作為肺癌預后判斷的潛在分子標志物。另外，有研究報道單個microRNA包括let-7、miR-34a、miR-374a、miR-181a、miR-221、miR-200c、miR-218等的低表達預示肺癌的低存活率或高復發(fā)性；一些microRNA包括miR-21、miR-183家族、miR-31、miR-16、miR-92a-2、miR-126等高表達則提示預后不佳。

其他標志物是基于多個microRNA的組合表達水平來了解肺癌的預后。血清中高水平的miR-486和miR-30d聯(lián)合低水平的miR-1和miR-499可以顯著預測NSCLC的不良預后。除microRNA水平外，microRNA甲基化狀態(tài)的改變也可獨立預測肺癌預后。miR-9-3和miR-124-2 / 3的甲基化與肺癌的晚期T分期有關(guān)，整個甲基化位點的數(shù)量越高，生存率越差。且miR-34b / c的甲基化與第I階段的NSCLC高復發(fā)和低總體生存率獨立相關(guān)[21]。因此，microRNA與肺癌的生存率密切相關(guān)，其可作為肺癌預后判斷的有效指標。

4 結(jié) 語

MicroRNA不僅是許多癌癥相關(guān)基因的調(diào)節(jié)者，而且是重要的癌基因或抑癌基因。而外周血中microRNA的穩(wěn)定存在和可檢測性，將有望用于肺癌的早期診斷、治療以及預后的判斷。但外周血microRNA對肺癌的調(diào)控是一個復雜網(wǎng)絡，受多因素影響，將microRNA運用到臨床尚有許多難題需要解決。因此深入探究microRNA與肺癌之間的作用及其作用機制，將有望成為肺癌患者的新診斷標志物及基因治療的有效靶點。

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