Wilms腫瘤基因在生長發(fā)育及非腫瘤性疾病中作用研究

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(中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410008)

Wilms腫瘤基因(Wilms’ tumor gene, WT1)位于染色體11p13處，因首次在兒童腎癌腎母細(xì)胞瘤(Wilms腫瘤)中克隆出來而得名[1]。哺乳動(dòng)物WT1基因長約50 kb，包含10個(gè)外顯子，其在C端DNA結(jié)合區(qū)域有4個(gè)鋅指樣結(jié)構(gòu)，是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子，具有多種轉(zhuǎn)錄特性，可以通過激活或者抑制靶基因影響細(xì)胞增殖、生長、凋亡等[2]；此外，WT1能夠維持上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT )和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)之間的平衡[3]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，WT1基因可以通過轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、選擇性剪切和RNA修飾的形式相結(jié)合產(chǎn)生36種潛在的亞型，在這36種潛在亞型中，常見亞型有4種：在第3和第4鋅指結(jié)構(gòu)之間包含賴氨酸，蘇氨酸和絲氨酸(+KTS)和缺少這三種氨基酸(-KTS)這兩種亞型，以及在第5外顯子區(qū)域，通過選擇性剪切產(chǎn)生的含中間17個(gè)氨基酸(+17AA)和缺少這17個(gè)氨基酸(-17AA)兩種亞型，分別標(biāo)記為亞型A(-17AA/-KTS;-/-)、亞型B(+17AA/-KTS;+/-)、亞型C(-17AA/+KTS;-/+)和亞型D(+17AA/+KTS;+/+)[4]。研究報(bào)道，WT1這4種亞型的功能可能存在差異[5-6]：例如，在調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)和轉(zhuǎn)移過程中，亞型B和C過表達(dá)細(xì)胞系能夠明顯增強(qiáng)血管生成擬態(tài)形成能力，且細(xì)胞遷移率更高；在髓性白血病中，亞型D高表達(dá)于慢性和急性患者，亞型B在急性患者中表達(dá)高于慢性患者，而亞型C則主要在慢性患者中高表達(dá)，提示W(wǎng)T1各個(gè)亞型有望成為輔助診斷髓性白血病的分子標(biāo)記。目前有關(guān)WT1的研究主要集中在腫瘤方面；近年來研究表明，WT1 基因還參與了生長發(fā)育調(diào)控及一些非腫瘤性疾病的發(fā)生。

1 WT1與生長發(fā)育

WT1編碼的蛋白對于一些組織器官的發(fā)育是必不可少的。在胎兒發(fā)育時(shí)期，WT1對腎臟、性腺、脾臟等器官的發(fā)育至關(guān)重要，胚胎小鼠WT1基因敲除可出現(xiàn)腎臟、性腺和脾臟發(fā)育缺陷，在發(fā)育中期則可因冠狀動(dòng)脈血管發(fā)育缺陷而死亡。WT1基因敲除小鼠出生后亦可出現(xiàn)腎小球硬化、胰腺和脾臟萎縮、骨組織和脂肪嚴(yán)重減少以及紅細(xì)胞生成障礙等[7]。WT1還參與心外膜的分化和再生以及心臟血管形成，在維持心臟正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

1.1 WT1和腎臟發(fā)育腎臟在發(fā)育過程中，可形成前腎、中腎和后腎；前腎和中腎是暫時(shí)性的器官，在胚胎發(fā)育過程中逐漸退化，后腎則發(fā)育成永久性腎臟。功能性腎臟發(fā)育主要依賴于后腎基質(zhì)細(xì)胞和來自中胚層的輸尿管交互作用。WT1基因首先表達(dá)于中胚層，進(jìn)而表達(dá)于各類細(xì)胞，調(diào)控后腎的發(fā)育。腎間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換最終形成腎元，而在逗號(hào)小體發(fā)育期和S小體發(fā)育期，間質(zhì)細(xì)胞中WT1表達(dá)水平持續(xù)升高。在成熟的腎臟中，WT1的表達(dá)局限于腎小球足細(xì)胞，調(diào)控足細(xì)胞的發(fā)育，從而維持腎小球?yàn)V過屏障完整；成熟足細(xì)胞中WT1缺失能夠激活足細(xì)胞Notch信號(hào)，參與腎小球硬化癥早期發(fā)病過程[8]。研究報(bào)道，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5 (IGFBP5) 表達(dá)能夠調(diào)控后腎發(fā)育過程中上皮的形成，在后腎原基細(xì)胞中與WT1共表達(dá)，抑制WT1蛋白的表達(dá)能夠顯著抑制IGFBP5的轉(zhuǎn)錄，腎臟形成從而受到嚴(yán)重影響，因此，WT1激活I(lǐng)GFBP5基因的表達(dá)可能是腎臟形成過程中重要的調(diào)控機(jī)制[9]。另外，視黃酸(RA)號(hào)對腎臟發(fā)育必不可少，RA合成酶ALDH1A1、ALDH1A2 和ALDH1A3在腎器官形成和腎元分化過程中呈現(xiàn)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式：在S小體管狀結(jié)構(gòu)分化過程和輸尿管芽結(jié)構(gòu)發(fā)育過程中，可檢測到ALDH1A1和ALDH1A3表達(dá)，但在足細(xì)胞分化階段并不表達(dá)ALDH1A1和ALDH1A3；ALDH1A2主要表達(dá)在基質(zhì)，其在逗號(hào)小體近端表達(dá)很弱，但在S小體和第三階段腎元發(fā)育期呈一過性高表達(dá)，但是在第四期腎元的足細(xì)胞中表達(dá)急劇下降。WT1能夠負(fù)向調(diào)控ALDH1A1、ALDH1A2 、ALDH1A3，進(jìn)而參與腎臟發(fā)育的整個(gè)過程[10]。WT1基因發(fā)生突變會(huì)影響腎臟的正常發(fā)育和功能，可導(dǎo)致各種腎臟疾病，甚至出現(xiàn)終末期腎功能衰竭。

1.2 WT1和心臟發(fā)育心臟是胚胎發(fā)育過程中第一個(gè)形成并發(fā)揮功能的器官，負(fù)責(zé)哺乳動(dòng)物胚胎中營養(yǎng)和氧氣的輸送。心外膜經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換產(chǎn)生心血管祖細(xì)胞，祖細(xì)胞最終分化成冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞、心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞等，各細(xì)胞間的“對話”對心臟的發(fā)育至關(guān)重要[11]：例如，在心臟形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞一方面形成血管腔維持心肌細(xì)胞的血氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，另一方面通過自分泌和旁分泌途徑與心肌細(xì)胞“對話”調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞發(fā)育與舒縮功能[12]。在胚胎心臟形成過程中，WT1可在心外膜細(xì)胞及其衍生細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)控胚胎發(fā)育過程上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及相關(guān)細(xì)胞的分化，而敲除WT1能夠明顯減少心臟間充質(zhì)干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞生成[13]。在成熟心臟冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，存在WT1陽性表達(dá)，而WT1基因沉默則能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[14]。在小鼠心肌梗死模型中，心臟內(nèi)皮細(xì)胞中WT1表達(dá)一過性上調(diào)[15]。WT1基因可通過調(diào)控SnaiI、CdhI轉(zhuǎn)錄，調(diào)控β-catenin和RALDH2 信號(hào)通路來參與心外膜內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，進(jìn)而來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長和冠脈系統(tǒng)形成[16]。上述研究提示，WT1不僅參與了心血管系統(tǒng)的發(fā)育成熟，而且對于維持正常心血管功能亦發(fā)揮重要作用。

1.3 WT1與間充質(zhì)干細(xì)胞分化分別分離C57雄性小鼠附睪、腸系膜、腹膜后、網(wǎng)膜、心外膜、腎周內(nèi)臟脂肪組織、腹股溝皮下白色脂肪組織以及棕色脂肪組織進(jìn)行消化離心，獲得具有干細(xì)胞特性的基質(zhì)血管組分(SVF)，利用譜系分析顯示，內(nèi)臟SVF中存在大量WT1陽性細(xì)胞，而皮下SVF、棕色SVF以及成熟的脂肪細(xì)胞幾乎檢測不到WT1陽性細(xì)胞存在，因此WT1被視為內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一[17]。在人內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞分化過程中，WT1能夠促進(jìn)視黃酸(RA)合成，阻礙內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞早期成脂作用[18]。肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞(HSCs)亦來源于WT1陽性表達(dá)的細(xì)胞群，WT1能夠直接影響HSCs分化，其機(jī)制可能也與肝臟受損后，RA生成增加有關(guān)，DNA甲基化是調(diào)控多功能干細(xì)胞分化的重要機(jī)制，WT1能夠與甲基胞嘧啶加雙氧酶Tet2結(jié)合，促進(jìn)DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)HSCs分化[19]。

2 WT1和疾病

WT1基因具有4個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，這些特殊的結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)Χ喾NRNA、DNA和蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，從而參與多種生物學(xué)過程。該基因突變會(huì)改變鋅指結(jié)構(gòu)域與RNA、DNA和蛋白的結(jié)合能力而導(dǎo)致功能異常，最終參與多種疾病，尤其是腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展。有趣的是，隨著對WT1基因研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)WT1不僅參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其也參與了糖尿病腎病、高血壓和肥胖等多種非腫瘤性疾病的發(fā)病。

2.1 WT1和肥胖脂質(zhì)代謝與脂肪細(xì)胞分化異常導(dǎo)致能量攝入與消耗不平衡是誘發(fā)肥胖的直接原因，而肥胖與高脂血癥、高血壓、代謝綜合征、冠心病、房顫、抑郁等心血管等疾病密切相關(guān)[20]，同時(shí)也與肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥存在關(guān)聯(lián)[21]。肥胖可以分為由內(nèi)臟脂肪堆積引起的腹型肥胖和由皮下脂肪堆積引起的周圍型肥胖；大量研究表明，內(nèi)臟脂肪堆積是胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病及動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等發(fā)病的關(guān)鍵因素[22]，而皮下脂肪則可能發(fā)揮保護(hù)作用：例如，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖和2型糖尿病的C57BL/6J雄性 小鼠，在其皮下白色脂肪中組織注射合成的脂肪性“雞尾酒”(基質(zhì)凝膠，凝膠微球，和bFGF)以促進(jìn)脂肪分化，發(fā)現(xiàn)注射10周后，小鼠的葡萄糖耐量以及對胰島素的敏感性得以顯著改善[23]；對健康、超重/中度肥胖的成年受試者內(nèi)臟脂肪組織、皮下脂肪組織進(jìn)行計(jì)算機(jī)斷層掃描和胰島素敏感性檢測，結(jié)果顯示內(nèi)臟脂肪組織比重越高，胰島敏感性越差，而皮下脂肪組織比重越高則其對胰島素敏感性越好[24]。皮下脂肪的這種保護(hù)作用機(jī)制并不太清楚，可能與皮下脂肪庫中產(chǎn)熱脂肪活性較高有關(guān)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在3種不同的脂肪：白色脂肪、米色脂肪與棕色脂肪，白色脂肪以儲(chǔ)能為主，棕色脂肪來源于Mfy5+細(xì)胞，高表達(dá)解偶聯(lián)蛋白Ucp1，通過解偶聯(lián)呼吸作用將能量轉(zhuǎn)化為熱能；米色脂肪主要存在于皮下白色脂肪庫中，是一種新型產(chǎn)熱脂肪，基礎(chǔ)狀態(tài)下Ucp1的水平介于白色脂肪與棕色脂肪之間，在冷暴露、β-腎上腺激素受體激動(dòng)劑、cAMP誘導(dǎo)下，白色脂肪庫中米色脂肪活性顯著增高，解偶聯(lián)蛋白Ucp1表達(dá)增加，從而發(fā)揮耗能產(chǎn)熱的功能[25]。研究發(fā)現(xiàn)，WT1高表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞中視黃酸(RA)的生成，從而阻礙早期成脂，發(fā)揮抑制白色脂肪的分化作用[26]。2014年， Paul,等研究發(fā)現(xiàn)，WT1敲除小鼠的脂肪組織基質(zhì)血管組分(SVF)中產(chǎn)熱脂肪形成相關(guān)基因Cidea、Prdm16、Ucp1 mRNA水平顯著上調(diào)[27]，提示W(wǎng)T1可能參與內(nèi)臟白色脂肪脂肪向米色脂肪轉(zhuǎn)化調(diào)控。

2.2 WT1和高血壓眾所周知，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在高血壓等心血管疾病發(fā)病中地位重要，血漿高腎素水平可作為高血壓的生物學(xué)標(biāo)記之一[28]。研究報(bào)道，缺失三個(gè)氨基酸的WT1剪切異構(gòu)體WT1(-KTS) 能夠抑制腎素基因的轉(zhuǎn)錄，而WT1(-KTS) 發(fā)生突變后會(huì)導(dǎo)致血漿中腎素水平升高，增加高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，雄性自發(fā)性高血壓SHR大鼠出生4周左右便可出現(xiàn)腎小球膠原纖維沉積，腎功能受損，伴隨腎皮質(zhì)WT1表達(dá)下調(diào)[30]，提示W(wǎng)T1不僅通過調(diào)節(jié)RAAS參與高血壓發(fā)病，可能還與高血壓腎病等并發(fā)癥密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞維生素D受體(VDR)在維持內(nèi)皮細(xì)胞功能和控制血壓中起著重要作用，使用VDR激動(dòng)劑能夠引起血管內(nèi)皮功能紊亂進(jìn)而導(dǎo)致高血壓等一系列的心血管疾?。籚DR基因突變小鼠一氧化氮合成酶(NOS)表達(dá)下調(diào)，一氧化氮(NO)合成降低，可引起內(nèi)皮功能紊亂[31]。用cDNA陣列雜交分析發(fā)現(xiàn)，VDR是WT1基因的下游基因，人類WT1基因可與VDR啟動(dòng)子結(jié)合，從而激活VDR基因表達(dá)[32]。

2.3 WT1和糖尿病腎病糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN) 是一種危害性較大的糖尿病慢性并發(fā)癥，可出現(xiàn)腎小球肥大/ 硬化、基底膜增厚、間質(zhì)纖維化等病變，最后引起不同程度的蛋白尿甚至嚴(yán)重的腎功能障礙[33]。在腎臟發(fā)育過程中，WT1基因在間質(zhì)細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞表達(dá)，能夠使間質(zhì)細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的足細(xì)胞，并調(diào)控足細(xì)胞的增殖與分化。足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)病的早期特征，糖尿病腎病患者足細(xì)胞數(shù)量減少，功能受損；臨床上通過WT1免疫染色計(jì)算足細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而根據(jù)足細(xì)胞的數(shù)量診斷糖尿病腎病，因此，WT1陽性表達(dá)的足細(xì)胞數(shù)少于正常水平被認(rèn)為是足細(xì)胞損傷的早期生物標(biāo)記。研究報(bào)道，C-Maf誘導(dǎo)蛋白CMIP在足細(xì)胞相關(guān)疾病中過度增生，并且能夠改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。在生理?xiàng)l件下WT1是CMIP的抑制因子，WT1基因能夠與其啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，從而維護(hù)腎臟功能[34]。另外，下調(diào)WT1表達(dá)能夠招募低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP6)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路， 而β-catenin激活能夠促進(jìn)足細(xì)胞功能紊亂和細(xì)胞凋亡，誘發(fā)蛋白尿形成[35]；而且β-catenin可觸發(fā)泛素介導(dǎo)的WT1蛋白降解，進(jìn)一步降低WT1水平；而增加WT1表達(dá)水平則能夠維護(hù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，減少足細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，對 β-catenin 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷可發(fā)揮保護(hù)作用[36]，從而延緩糖尿病腎病進(jìn)程。

3 展 望

WT1基因具有鋅指結(jié)構(gòu)域，可以與DNA、RNA、蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。既往主要關(guān)注的是WT1在腫瘤中的作用，但對其在生理功能調(diào)控及及非腫瘤性疾病中的作用及機(jī)制并不十分清楚。隨著人們生活水平的提高和生活方式的轉(zhuǎn)變，肥胖及相關(guān)代謝性疾病已日益成為繼腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題；WT1是內(nèi)臟脂肪特異性標(biāo)記因子之一，其在內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞中表達(dá)水平較高，但其對內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分化與功能是否具有調(diào)控作用，以及是否參與肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的發(fā)病，目前知之甚少。深入探討WT1基因在生長發(fā)育和代謝性疾病中的作用及機(jī)制，可為代謝性疾病等非腫瘤性疾病的防治提供新的依據(jù)。

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