單堿基編輯工具及在基因治療中的應(yīng)用及前景

陶永 趙幸樂(lè) 康文 吳皓

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

CRISPR（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）是由單鏈的guide RNA和有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白構(gòu)成，可以實(shí)現(xiàn)在基因組幾乎所有位置的雙鏈DNA斷裂修復(fù)（DSB）。在CRISPR系統(tǒng)中，核酸內(nèi)切酶蛋白(Cas)和guide RNA分子形成復(fù)合物，復(fù)合物可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)來(lái)定位和切割一段目標(biāo)核酸序列（前間隔序列）。前間隔序列附近必須有Cas蛋白依賴的短核酸序列——PAM[1]。目標(biāo)核酸序列切割后通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）可恢復(fù)DNA的完整性。CRISPR系統(tǒng)的出現(xiàn)及其在真核生物基因組編輯領(lǐng)域的應(yīng)用[2]引發(fā)了生命科學(xué)的巨大進(jìn)步，但研究大多基于非同源末端連接修復(fù)技術(shù)[3]。盡管在細(xì)胞系中，通過(guò)抑制NHEJ、優(yōu)化DNA模板等方法，利用HDR的基因編輯技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步，但是利用HDR精確修復(fù)真核生物基因組的效率仍然非常低。

為了提高基因編輯效率實(shí)現(xiàn)在體基因編輯，通過(guò)整合化學(xué)生物學(xué)和基因編輯的方法，實(shí)現(xiàn)了DNA上一種堿基直接通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種堿基，且不會(huì)誘導(dǎo)DSB的形成[4]，這種不依賴于同源重組修復(fù)的基因編輯方法稱為單堿基編輯(Base editing)。單堿基編輯依靠胞苷脫氨酶進(jìn)行誘導(dǎo)突變，無(wú)需切割雙鏈DNA和提供供體模板，可減少DNA損傷并簡(jiǎn)化編輯過(guò)程。單堿基編輯工具可以高效的進(jìn)行堿基修改，在多個(gè)領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。

1 單堿基編輯原理

單堿基基因編輯法可以精確地、不可逆地實(shí)現(xiàn)從一種堿基對(duì)到另一種堿基對(duì)的轉(zhuǎn)變，而無(wú)需DSB或HDR。最初的堿基編輯器是用一個(gè)單鏈DNA特異性胞苷脫氨酶結(jié)合一個(gè)失活的Cas9(dCas9)，在靶區(qū)域使胞嘧啶(C)·鳥嘌呤(G)堿基對(duì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)·腺嘌呤(A)。脫氨酶-Cas9復(fù)合體利用Cas9:guide RNA:DNA三元復(fù)合體的R環(huán)中的一小段單鏈DNA，在靶序列的很小的窗口（約3至5個(gè)核苷酸）內(nèi)催化胞嘧啶脫氨轉(zhuǎn)化為尿苷。

為了促進(jìn)真核生物中U·G轉(zhuǎn)化為T·A，研究人員發(fā)現(xiàn)將83個(gè)氨基酸的尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）結(jié)合到脫氨酶-Cas9復(fù)合體上，可以抑制尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶。通過(guò)融合褐家鼠APOBEC1胞苷脫氨酶、化膿性鏈球菌Cas9n(D10A)和枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2 UGI，生成了堿基編輯器——BE3。BE3可形成C·G到T·A的永久性轉(zhuǎn)變，有比HDR更高的編輯效率（15-75%vs＜5%），插入突變率（低于5%）比Cas9基因編輯方法更低。除此之外，多項(xiàng)研究表明BE3比Cas9擁有更低的脫靶率[5]。

為了進(jìn)一步降低非特異性的突變，將BE3和高保真的SpCas9(HF-Cas9)相結(jié)合[6]，降低了BE3和非目標(biāo)位點(diǎn)的親和力，從而創(chuàng)造出了擁有更低脫靶率的HF-BE3[7]。然而，它同時(shí)也降低了目標(biāo)位點(diǎn)的編輯率。

為了實(shí)現(xiàn)單堿基編輯的可調(diào)控性，研究人員設(shè)計(jì)了一種可以調(diào)控的堿基編輯器，將催化自我切割的RNA酶加入guide RNA，只有當(dāng)配體和它結(jié)合的時(shí)候，guide RNA才發(fā)揮作用[8]。雖然該體系在沒(méi)有配體的情況下，仍表現(xiàn)出一定的活性，但是其效率比標(biāo)準(zhǔn)的guide RNA低很多，這就使得堿基編輯受控于配體。其它活性誘導(dǎo)的方法，如借助光遺傳學(xué)[9-10]，將光敏感小分子[11-13]結(jié)合到堿基編輯器上，使得基因編輯可以得到調(diào)控。

除了BE3，還有多種方法來(lái)解決DSBs的固有局限。Target-AID是一種類似BE3的堿基編輯器，它使用了可選擇的結(jié)構(gòu)域和脫氨酶，從而使C·G到T·A的轉(zhuǎn)變過(guò)程中有一個(gè)可變的脫氨基作用區(qū)域[14]。另外，通過(guò)改變PAM序列獲得了堿基編輯能力更強(qiáng)的BE3變異體，將可編輯的潛在基因庫(kù)增加了2.5倍，擁有更高的靈敏度[15]和更低的脫靶率[7]。

基于之前的研究推出的第四代的堿基編輯器BE4具有尿嘧啶糖基化酶抑制作用，可使目標(biāo)G·C轉(zhuǎn)化為T·A外其它堿基對(duì)的概率減半[16]。

ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中存在3000種基因變異可以通過(guò)C-T的堿基替換來(lái)修復(fù)。然而，鑒于PAM序列的要求（NGG），估計(jì)只有300到900個(gè)可以編輯[4]。為了解決這些限制，研究人員將BE系統(tǒng)和進(jìn)化的Cas9系統(tǒng)結(jié)合，這些Cas9變異體擁有多種PAM序列，使得BE可以修改2200個(gè)C:T或G:A的點(diǎn)突變[15,16]。

臨床致病突變多為C·G到T·A，所以需要開發(fā)新的堿基編輯工具。最近報(bào)道的腺嘌呤堿基編輯器(ABEs)可以促進(jìn)A·T向G·C轉(zhuǎn)化，可以高效地使人來(lái)源細(xì)胞A·T向G·C轉(zhuǎn)化，基因編輯的效率可達(dá)50%，DSB的檢出率低于0.1%。相比于Cas9核酸酶介導(dǎo)的基因編輯，ABEs可以高效修改點(diǎn)突變基因，是在體基因編輯的良好工具。

2 單堿基編輯工具的應(yīng)用

由于單堿基編輯極大避免了隨機(jī)插入，基因敲除的結(jié)果更有預(yù)測(cè)性，同時(shí)也避免潛在的細(xì)胞毒性或混雜的DSB中間體及其副產(chǎn)物的形成。盡管單堿基編輯問(wèn)世時(shí)間不長(zhǎng)，卻已經(jīng)展示了巨大的應(yīng)用價(jià)值。

單堿基編輯工具在體應(yīng)用最早在植物育種中開始。BE3最早用來(lái)編輯大米中的OsNRT1.1B、Os-SLR1、OsPDS和OsSBEII基因，C·G到T·A的編輯效率達(dá)到12-20%[17]。其它的研究如用BE3編輯大米、小麥、玉米的眾多基因，C·G到T·A的編輯效率可高達(dá)44%[18]。另外，Target-AID也被用來(lái)開發(fā)除草劑抗性水稻，C·G到T·A的點(diǎn)突變效率高達(dá)32%；通過(guò)改變西紅柿中涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，多達(dá)21%的后代中含有純合子、雜合子或雙等位基因的堿基替換[19]。

單堿基編輯工具能把胞嘧啶精確地轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，使其作為一種潛在的治療方法，可針對(duì)性地插入突變，已廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物模型，包括：

（1）通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法把BE3導(dǎo)入到小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中,糾正了阿爾茨海默癥相關(guān)的APOE4基因突變。同樣的方法修復(fù)了小鼠乳腺癌細(xì)胞中TP53突變,效率分別達(dá)58%-75%和3%-8%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CRISPR/Cas9，而且插入缺失率也更低[4]。

（2）將攜帶有BE3:sgRNA復(fù)合體的RNP脂質(zhì)納米粒注射入斑馬魚胚胎中,成功修改了TYR1,TYR2,TYR3基因，效率為5%，脫靶率＜2%[7]。

（3）在Ldlr敲除導(dǎo)致的高血脂小鼠予以BE3-Angptl3治療，可以減少血液中甘油三脂（下降56%）和膽固醇（下降51%），從而為單堿基編輯工具治療脂質(zhì)代謝異常提供依據(jù)[20]。

（4）通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，在小鼠肝臟中成功對(duì)PCSK9進(jìn)行了堿基編輯，編輯的效率為19%至34%，使血漿膽固醇水平下降了約30%[21]。

（5）通過(guò)RNP電穿孔和mRNA顯微注射把BE3注入到小鼠胚胎，來(lái)糾正Dmd,Tyr基因，治療了假性肥大性肌影響不良和白化病，突變頻率16%-100%[22]。

單堿基編輯工具已經(jīng)在內(nèi)耳得到應(yīng)用：向耳蝸內(nèi)導(dǎo)入脂質(zhì)體包裹的BE3蛋白:guide RNA可以在內(nèi)耳組織實(shí)現(xiàn)堿基的置換：將BE3蛋白（原液濃度57.7mM）與guide RNA（原液濃度100mM）以1：1.1摩爾比預(yù)先混合，然后以1：1體積比與Lipofectamine 2000混合。將1.2-1.5ml混合液注入耳蝸的底圈中階，速率為250 nl/min。3-4天后提取DNA后進(jìn)行高通量測(cè)序。實(shí)驗(yàn)證實(shí)將脂質(zhì)體混合BE3-guide RNA后注射至新生小鼠內(nèi)耳，可以修改內(nèi)耳細(xì)胞的VEGFA基因，效率為＜1.5%，插入缺失率為＜0.1%[7]。相較于體外編輯效率，體內(nèi)的堿基轉(zhuǎn)化效率偏低，但內(nèi)耳的局部注射可以靶向多種細(xì)胞，為內(nèi)耳基因治療的提供了新的工具。

BE3還可用來(lái)實(shí)現(xiàn)CRISPR-STOP和iSTOP，通過(guò)引入終止密碼子實(shí)現(xiàn)基因的敲除[23]。

ABEs可將A·T轉(zhuǎn)化為G·C，單堿基編輯工具治療致病突變的適應(yīng)癥大大增加。β-球蛋白基因突變可引起多種血液疾病，但是γ-球蛋白基因HBG1和HBG2的啟動(dòng)子突變導(dǎo)致攜帶HPFH的人群能夠抵抗一些β-球蛋白性疾病。利用ABEs同時(shí)把HBG1和HBG2啟動(dòng)子的198位的T轉(zhuǎn)換成C，可以使胎兒血紅蛋白在成年人中持續(xù)表達(dá)。鐵貯積癥遺傳性血色?。℉HC）是一種常染色體隱性遺傳性疾病，通常是由HFE基因第845位的G突變引起HFE蛋白中C282Y的轉(zhuǎn)變（282位半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼幔?導(dǎo)致鐵吸收過(guò)多，危及生命的血清鐵蛋白升高[24]。用ABE7.10和guide RNA共同轉(zhuǎn)染可以將目標(biāo)腺嘌呤導(dǎo)入到含有HFE C282Y突變的不可再生的成淋巴細(xì)胞系(LCL)。結(jié)果觀察到282位的酪氨酸有28%的轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，且在靶位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何不想要的編輯或插入突變。目前的ABEs編輯方法仍需進(jìn)一步改造以用于潛在的臨床基因治療，如發(fā)展ABEs使其有更廣泛的PAM。這些例子表明，ABEs可在人類細(xì)胞中修復(fù)疾病的基因突變，也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生基因突變來(lái)抑制某些遺傳病的表型。

CRISPR-X和Target-AID誘導(dǎo)突變(TAM)[25]利用dCas9-胞苷脫氨酶融合技術(shù)，可導(dǎo)致guide RNA靶定基因組區(qū)域的飽和誘變。當(dāng)缺乏堿基切除修復(fù)抑制劑如UGI時(shí)，UGI中間體通過(guò)堿基切除修復(fù)酶尿嘧啶DNA糖基化酶變成一個(gè)空白堿基位點(diǎn)，接著通過(guò)DNA修復(fù)過(guò)程形成G·C和A·T堿基對(duì)，而不是T·A產(chǎn)物。CRISPR-X和TAM利用此修復(fù)結(jié)果來(lái)隨機(jī)突變C·G堿基對(duì)，由此產(chǎn)生遺傳編碼的突變庫(kù)。

3 單堿基編輯工具的前景

對(duì)和dCas9相結(jié)合的酶進(jìn)行進(jìn)一步改造可能會(huì)擴(kuò)大堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。特別是改造脫氨酶或DNA修復(fù)機(jī)制可以使不同的堿基轉(zhuǎn)換成為可能。脫氨酶是由各種酶組成的一個(gè)龐大的家族。腺苷脫氨酶的使用將會(huì)擴(kuò)大目標(biāo)堿基的范圍從而實(shí)現(xiàn)腺嘌呤向其它堿基的轉(zhuǎn)換。

堿基編輯可以有效地誘導(dǎo)突變，而后生成基因變異庫(kù)以篩選出特定的表型；結(jié)合這兩種應(yīng)用，我們可以產(chǎn)生大量的表型和致病性的單核苷酸多態(tài)性。大多數(shù)已知的疾病相關(guān)的基因變異都是點(diǎn)突變[26]，堿基編輯器可以修復(fù)點(diǎn)突變，同時(shí)也可以作用于野生型而產(chǎn)生突變。最近，也有人用活性Cas9通過(guò)飽和突變的方法來(lái)確認(rèn)影響MYB表達(dá)的隨機(jī)突變[27]。除了產(chǎn)生基因突變之外，廣泛的、多樣化的堿基編輯器還可以識(shí)別并影響表型已知的和新的基因突變。這些方法可以確定基因突變與表型的關(guān)系，可增加對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的氨基酸的認(rèn)識(shí)。

雖然對(duì)Cas9中靶和脫靶效應(yīng)的量化已經(jīng)做了很多工作[28-30]，但是對(duì)堿基編輯卻仍然沒(méi)有出現(xiàn)類似的量化方法。細(xì)胞[31]和組織[32]中無(wú)偏差的、敏感的、全基因組的脫靶檢測(cè)方法依賴于雙鏈DNA的斷裂，并不適合于單堿基編輯。雖然堿基編輯器脫靶可以用體外實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)[5]，例如全基因組測(cè)序和有針對(duì)性的測(cè)序，但尚未開發(fā)出用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中的脫靶效率。這些新方法將對(duì)促進(jìn)單堿基編輯的脫靶檢測(cè)具有關(guān)鍵作用。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和成熟，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)耳聾基因動(dòng)物模型的建立已成為現(xiàn)實(shí)[33]，基因編輯技術(shù)在遺傳性耳聾的治療中也將發(fā)揮更大的作用[34]。單堿基編輯工具是新一代高效基因編輯工具，可將一個(gè)目標(biāo)堿基對(duì)在不需要DSB的情況下轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膲A基對(duì)，是遺傳性疾病的研究和治療的有效技術(shù)。最近的研究表明單堿基編輯工具可應(yīng)用于內(nèi)耳研究，是內(nèi)耳基因治療的潛在工具。

CRISPR功能強(qiáng)大，但HDR效率尚不足以在體進(jìn)行基因修改。單堿基編輯工具可以實(shí)現(xiàn)在體基因修改，是基因治療的良好工具。目前單堿基編輯工具只能實(shí)現(xiàn)G·C轉(zhuǎn)化為T·A或是A·T轉(zhuǎn)化為G·C，適應(yīng)癥較少。隨著單堿基編輯工具的研發(fā)，未來(lái)可能通過(guò)堿基的任意轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)基因治療。

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