甜葉菊白絹病的特性研究

劉錄德

（甘肅省武威市涼州區(qū)金河鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，武威733000）

在印度引起甜葉菊枯萎病的3種土傳病害是白絹?。⊿clerotium rolfsii）、鐮刀菌枯萎?。‵usarium solani）和立枯絲核菌根腐?。≧hizoctonia bataticola），其中白絹病的威脅較大，發(fā)病率高達39.65%，是分布在甜葉菊種植任何地區(qū)的主要病害，17個地點調(diào)查獲得14個甜葉菊白絹病分離物：SrNID（Nidshoshi）、SrHOS（Hosagudda）、SrGKVK （UAS,Bengaluru）、SrTHI （Thindlu）、SrKAL （Kalenahalli）、SrSAI （Saidapur）、SrSIR（Sirsi）、SrTHIR（Thirthalli）、SrRIP（Rippenpete）、SrGAN（Gangavati）、SrBGM（Belgaum）、SrGDG（Gadag）、SrRCR（Raichur）、SrMYS（Mysore）。對其特性進行詳細研究，對綜合預(yù)防和控制其發(fā)生有重要意義。本文綜述了甜葉菊白絹病的特性研究情況，以期為我國甜葉菊病害控制提供參考和借鑒。

1 甜葉菊白絹病形態(tài)、生理生化及分子水平特性

1.1 甜葉菊白絹病形態(tài)、生理生化特性

1.1.1 生長率 不同的甜葉菊白絹病菌株生長速率為0.63～1.25mm/h。根據(jù)生長率，將菌株分為3組。Ⅰ組快速生長 （1.25mm/h）：SrGKVK、SrKAL、SrSAI、SrRCR 和 SrBGM；II組中等生長（≥0.94mm/h）：SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS；III組慢速生長（≥0.63 mm/h）：SrRIP、SrTHIR 和 SrGAN。 S.rolfsii分支發(fā)生在菌絲頂端，細胞壁合成和降解之間的微妙平衡調(diào)節(jié)著生長。β-1-3葡聚糖酶和葡聚糖合成酶兩種酶參與這個活動，這兩種酶的平衡控制S.rolfsii菌絲的生長和分支。

1.1.2 菌核萌動時間 不同菌株的菌核形成的時間不同。菌株分為3組。Ⅰ組 （第4天萌動）：SrGKVK、SrKAL、SrSAI、SrRCR 和 SrBGM；II組（第 5 天萌動）：SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS；III組（第7天萌動）：SrRIP、SrTHIR和SrGAN。所有的菌株，菌體最初白色，后變成深褐色。菌核顏色的變化也可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用或缺乏。

1.1.3 菌落顏色和類型 所有的菌株菌落除SrGAN、SrTHIR和SrRIP顯示白色外均呈淡白色。SrKAL、SrNID、SrTHI、SrGKVK、SrSIR、SrSAI、SrHOS、SrMYS、SRRCR、SrGDG 和 SrBGM 菌絲體呈緊密狀， 而 SrGAN、SrTHIR和SrRIP菌絲體呈蓬松狀。

1.1.4 菌核數(shù)和形狀、大小、重量 菌株SrKAL、SrNID、SrTHI、SrGKVK、SrSIR生產(chǎn)的菌核數(shù)較多（241～324個/板）； 菌株 SrGAN、SrTHIR、SrSAI、SrHOS、SrMYS、SrGDG、SrRCR 和 SrBGM 生產(chǎn)的菌核數(shù)最多 （310～346個/板）；SrRIP生產(chǎn)的菌核數(shù)很少（142個/板）。菌株SrNID、SrTHIR、SrMYS和SrRIP的菌核表現(xiàn)橢圓形而其它的為圓形。菌株菌核體大小的變化顯著。SrRIP、SrTHIR和SrGAN菌株最大，平均直徑分別為2.00mm、1.67mm 和 1.43mm；SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS 菌核為中型 （1.00～1.25mm）； 而 SrGKVK、SrKAL、SrRCR、SrSAI和SrBGM生產(chǎn)的菌核較小，分別為0.85、0.82、0.95、0.83和0.82 mm。 菌核體重量測試顯示差異明顯。SrTHIR菌株的百菌核最重（436mg），SrSAI菌株的最輕（272mg）。分為3類。I組重量270～304mg：SrGKVK、SrKAL、SrRCR、SrBGM 和 SrSAI；II組重量 310～342 mg：SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG和SrHOS；III組重量426～436mg：SrRIP、SrGAN和SrTHIR。結(jié)果清楚地表明分離物間菌核重量差異顯著。

1.1.5 菌核在培養(yǎng)皿的位置 關(guān)于菌核的位置，SrTHI、SrGKVK、SrRIP、SrSAI、SrHOS、SrBGM和SrGDG菌株的菌核最大達培養(yǎng)皿邊緣；SrGAN和SrSIR菌株的菌核集在中心；而菌株SrKAL、SrNID、SrTHIR、SrMYS和SrRCR產(chǎn)生的菌核在培養(yǎng)皿呈不規(guī)則分布。

1.1.6 菌絲體兼容性、生長兼容群 PDA板被標記成3個部分，活躍生長菌落（3～4d）的菌絲盤直徑為5mm，各分離物接種于PDA板各部位。接種后的板，在28℃培養(yǎng)5～15d。在14個菌株中發(fā)現(xiàn)7個生長兼容組。I組：兼容所有的 13 個菌株（SrKAL）；II組：兼容 12 個株（SrRIP）；III組：兼容 11 個菌株（SrNID）；IV 組：兼容 10 個菌株（SrBGM、SrHOS、SrMYS、SrTHI和 SrSIR）；V 組：兼容 9 個菌株（SrSAI、SrGDG 和 SrTHIR）；VI組：兼容 8個菌株（SrRCR）；VII：兼容表7個菌株（SrGAN和SrGKVK）。其中，SrKAL與其他菌株高度兼容。在相容反應(yīng)中，兩個菌株的菌絲在相互作用區(qū)混合；然而，在不兼容反應(yīng)中，出現(xiàn)大片的菌絲死亡區(qū)。在大多數(shù)的拮抗反應(yīng)，菌核均沿兩菌株溶解邊界形成，盡管有些菌絲可沿邊緣生長。

1.1.7 草酸生產(chǎn) 每個S.rolfsii菌株單獨在馬鈴薯葡萄糖液（PDB）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定草酸生產(chǎn)量。結(jié)果表明，不同菌株草酸生產(chǎn)有顯著變化，SrKAL的草酸生產(chǎn)量最大 （5.90mg/mL），其次是SrGKVK（5.80mg/mL）、SrBGM（5.12mg/mL）和 SrRCR（4.93mg/mL）。 然而，在 SrRIP 草酸生產(chǎn)量最少（1.33mg/mL），其次是 SrGAN（1.45mg/mL）和 SrTHIR（1.80mg/mL）。 其他菌株（SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS）為中等（2.90～3.80mg/mL）。草酸生產(chǎn)量和毒力呈正相關(guān)。

1.1.8 毒力指數(shù) 將14株菌株接種于甜葉菊上，研究其致病性變化。毒力最大的是SrKAL（指數(shù)10.00），在10d 使甜葉菊植株完全萎蔫；其次是 SrGKVK（8.33）、SrBGM（7.64）、SrSAI（6.41）和 SrRCR（6.11），分別需要12、13、15和15d使甜葉菊植株枯萎；毒力最小的是SrRIP，毒力指數(shù)為1.98，植株萎蔫所需時間最長。菌株最大毒力指數(shù)需要較少的時間導(dǎo)致植株萎蔫。基于毒力指數(shù)將菌株分為3組。I組（毒力指數(shù)6～10）：SrGKVK、SrGKVK、SrSAI、SrRCR、SrBGM；II組 （毒力指數(shù)＞3、＜6）：SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS；III組（毒力指數(shù)≤3）：SrGAN、SrTHIR 和 SrRIP。

1.1.9 綜合分組 毒力與萎蔫時間、菌核成熟、菌核大小、毒力指數(shù)和草酸生產(chǎn)有關(guān)。菌株生長率高，菌核成熟時間少，菌核小，毒力指數(shù)和草酸生產(chǎn)量高，短時間植株萎蔫的屬高劇毒；而生長率、菌核成熟度、菌核大小、毒力指數(shù)和草酸生產(chǎn)量都中等，那么需要中長的時間植株萎蔫的屬劇毒；而菌株生長速度緩慢，菌核成熟時間長，菌核大，毒力指數(shù)和草酸生產(chǎn)量都低，那么需要長時間植株萎蔫的屬低毒。根據(jù)萎蔫天數(shù)、生長率、菌核成熟度和大小，毒力指數(shù)、草酸生產(chǎn)量，S.rolfsii菌株分成3組。I組-高毒力菌株：SrGKVK、SrKAL、SrSAI、SrRCR 和 SrBGM，10～15d 植株萎蔫、真菌生長率高（1.25mm/h），6～7d 內(nèi)菌核成熟、菌核大小 0.85～0.95mm、毒力指數(shù) 6～10、生產(chǎn)草酸 4～6mg/mL；II組-中等毒力株：SrTHI、SrNID、SrSIR、SrMYS、SrGDG 和 SrHOS ，18～22d植株萎蔫、真菌生長速度中等（0.94mm/h）、菌核成熟時間中等、菌核大小1～1.50mm、毒力指數(shù)為3～6、草酸生產(chǎn) 2～4mg/mL；III組-低毒力菌株：SrTHIR、SrGAN 和 SrRIP，21～38d 植株萎蔫、真菌生長率低（0.63 mm/h）、菌核大小 1～3mm、毒力指數(shù) 1～2.5、草酸生產(chǎn) 1～2mg/mL。

1.2 甜葉菊白絹病分子研究

1.2.1 RAPD-PCR特性描述 使用傳統(tǒng)的形態(tài)差異很難區(qū)分這些菌株，使用RAPD和ITS檢測S.rolfsii菌株的變異很適用。用OPA、OPB和OPF系列引物來確定分離株之間的遺傳距離和構(gòu)建。24個引物用于擴增，其中OPA02、OPA04、OPA06、OPA09、OPB02、OPB4和OPF顯示100%的多態(tài)性。根據(jù)簡單匹配系數(shù)的遺傳相似性矩陣構(gòu)建評價S.rolfsii菌株間的遺傳相關(guān)性，相似系數(shù)為0.63～0.93。SrGDG （Gadag）和SrNID（Nidshoshi）之間的遺傳相似性最大；SrRIP（Rippenpete）和SrMYS（邁索爾）之間的遺傳相似性最小。聚類分析顯示 3大集群。SrMYS、SrKAL、SrRCR、SrSAI、SrBGM、SrTHI和 SrGKVK 為一類，SrTHIR 和 SrRIP 是在一個單獨的集群，SrGDG、SrNID、SrHOS、SrGAN和SrSIR在一個集群。

1.2.2 ITS-PCR特性描述 ITS-1和ITS-4引物用于14個S.rolfsii菌株rDNA的ITS區(qū)PCR擴增。14個菌株兩引物各得到一個650～700 bp單一條帶。這些結(jié)果證實，所有的菌株屬于Sclerotium屬。SrHOS、SrKAL、SrMYS和SrTHIR菌株的18S、5.8S和28SrDNA基因序列片段與NCBI公布的序列有100%的相似度，即，分別為 Athelia rolfsii菌株 HUTC1T1 （HQ895874.1）、Athelia rolfsii菌株 AS-1（JN241563.1）、Athelia rolfsii菌株NAGC12T1（HQ895931.1）和Athelia rolfsii 18S核糖體RNA基因（HM222638.1）。SrGAN和SrGDG與Athelia rolfsii菌株蘭花18S核糖體RNA基因序列（GQ358518.1）有99%相似性；SrNID和SrTHI與Athelia rolfsii菌株 AS-1 （JN241563.1） 有 99%相似性；SrBGM、SrRCR 和 SrSIR 與 Athelia rolfsii菌株 srpo3（KC460985.1）、Athelia rolfsii菌株 SR001 18S核糖體 RNA 基因（HQ420816.1）和 Athelia rolfsii菌株 LS341-1（GQ358518.1）有99%的相似性；SrGKVK和SrRIP菌株與Athelia rolfsii 18S核糖體RNA基因（HM222638.1）和Sclerotium delphinii菌株Sd-1（JQ982485.1）有98%相似性；而SrSAI與Athelia rolfsii菌株KACC42087 18S核糖體RNA基因（HM355751.1）有98%相似性。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 系統(tǒng)樹是所有14個菌株18SrDNA區(qū)核苷酸序列通過鄰近連接樹的結(jié)構(gòu)方法。發(fā)表的Athelia rolfsii菌株BeanScRs（登錄號：KC293992.1）序列從NCBI下載，被用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。14個S.rolfsii菌株的系統(tǒng)樹主要分為兩個集群。A集群包含甜葉菊的所有S.rolfsii（Athelia rolfsii）種，而B集群包括Athelia rolfsi i菌株BeanScRs（登錄號：KC293992.1）。由系統(tǒng)樹可見，14個S.rolfsii多樣性不豐富。Athelia rolfsii菌株BeanScRs（登錄號：KC293992.1）在樹狀圖與上述14菌株呈獨立分支。

2 環(huán)境條件對白絹病的影響

2.1 土壤溫度

土壤溫度是影響真菌生長的重要因素之一。S.rolfsii產(chǎn)生最大生長是在30℃（65.35%菌落），顯著優(yōu)于其它土壤溫度；而20℃和40℃溫度間沒有顯著差異；在50℃沒有菌落生長。菌核萌發(fā)率，在30℃達最大（92.67%），高于其它溫度；在45℃萌發(fā)最少（14.33%）；在50℃沒有菌核萌發(fā)。真菌在較高的溫度下活性降低，可能是由于缺乏最佳生長所需要的氧。

2.2 土壤水分

S.rolfsii在低含水量土壤存活好于高含水量土壤。在10%的土壤含水量真菌腐生活動達32.33%，在20%的土壤含水量真菌腐生活動達56.87%，在30%的土壤含水量真菌腐生活動達84.13%，土壤含水量＞30%，真菌腐生活動開始下降，至70%土壤含水量，真菌腐生活動降為12.67%。對于菌核萌發(fā)，在30%土壤含水量萌發(fā)率達100%；其次是20%、40%土壤含水量，萌發(fā)率各為80.13%、73.67%；70%土壤含水量萌發(fā)率最少（25.69%）。增加土壤含水量可能使土壤中的通氣量減少使病原菌由于供氧不足而失去活性。

2.3 土壤pH值

在pH 5.5～6.5真菌表現(xiàn)出中度到良好的生長，S.rolfsii最大真菌菌落為pH 6.0，pH 6.5真菌腐生活動是79.10%，pH 7.0和7.5真菌腐生活動分別為66.12%和53.33%，在pH 9.5腐生活動32.42%。菌核萌發(fā)不同處理也差異顯著。在pH 6.0時菌核萌發(fā)最高（92.25%），其次是 pH 6.5（90.00%）、pH 7.0（85.00%）和 pH 5.5（83.33%），在 pH 9.5（24.48%）和 pH 9.0（38.33%）菌核萌發(fā)最低。

2.4 土壤深度

在土壤1cm深度菌核萌發(fā)達最大（87.57%），隨著深度的增加菌核萌發(fā)率逐漸降低，在土壤深度15和16cm菌核萌發(fā)率僅2%，在土壤深度17～20cm，沒有菌核萌發(fā)。

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