甜菜中糖類的測定方法及應(yīng)用

張琨 ，周芹

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱），哈爾濱150080；4.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，哈爾濱150080）

甜菜是我國北方主要的糖料作物，目前甜菜種植面積每年約300萬畝（20萬公頃）[1]。栽培甜菜分為糖用型、葉用型、飼用型、食用型，其中以糖甜菜的種植面積最大，其主要功能是用來生產(chǎn)食糖。

糖甜菜中糖類主要為：單糖（主要是葡萄糖和果糖）、二糖（主要是蔗糖）、低聚糖（棉子糖和蔗果三糖）以及多糖[2－3]。在這些成分中，以蔗糖分含量最高。葡萄糖和果糖又稱為轉(zhuǎn)化糖或還原糖，在甜菜制糖過程中，轉(zhuǎn)化糖存在下，蔗糖的結(jié)晶受到影響，出現(xiàn)特殊晶形的結(jié)晶。在制糖工業(yè)中，從原料、中間制品到成品，或多或少都含有還原糖，其含量大小在一定程度上可以反映原料產(chǎn)品的質(zhì)量及制糖過程是否正常，分析貯藏甜菜的還原糖分可以了解甜菜是否變質(zhì)，還原糖含量越低，甜菜及其糖品的品質(zhì)會越好[2－3]。棉子糖又叫做功能性低聚糖，近年來，功能性低聚糖的品種越來越多，研究開發(fā)也較快，棉子糖具有其他低聚糖不具有的特殊功效，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[4－5]。蔗果三糖是由蔗糖和果糖以(2，6)－和(2，1)－鍵縮合而成的一種非還原性的三糖，此糖含量可作甜菜保藏質(zhì)量的指標(biāo)。甜菜多糖是從甜菜榨糖后剩下的甜菜粕中提取的一種白色片狀結(jié)晶物，由于其甜度較低，近年來被國內(nèi)外認(rèn)為是最好的膳食纖維之一。本文系統(tǒng)地介紹了這幾種糖類的測定方法。旨在為糖廠及種植者及時(shí)監(jiān)測甜菜中各種糖類含量，進(jìn)一步了解甜菜品質(zhì)變化提供切實(shí)可行的檢測方法。

1 單糖的測定方法

甜菜中最重要的單糖是葡萄糖和果糖，甜菜壓榨汁液或者萃取液中除了這兩種還原糖外，還含有下列單糖：甘油醛、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖及半乳糖，所有這些化合物都曾采用薄層色譜技術(shù)分離出來，在還原性物質(zhì)范圍內(nèi)，這些組分約占2%[6]。因此，本文主要介紹葡萄糖和果糖的測定方法。還原糖的測定方法很多，最常見的有旋光法、滴定法[7－8]、色譜法[9－19]、分光光度法[20－25]、電化學(xué)方法[26－32]及酶偶聯(lián)法[33－34]，其中，旋光法準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性都較差，所以只對后幾種方法進(jìn)行討論，篩選出目前適合甜菜上還原糖的測定方法，并對將來可能應(yīng)用在甜菜上的方法進(jìn)行探討。

1.1 滴定法

葡萄糖含有醛基，因而具有還原性。果糖含有一個(gè)羰基和多個(gè)羥基，羰基受羥基的影響，在堿性條件下也具有很強(qiáng)的還原性。所以滴定法就是確定一種氧化劑與甜菜中的還原糖發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而進(jìn)行定量的方法，又分為直接滴定法[7]、高錳酸鉀滴定法、奧氏試劑滴定法[8]等。這幾種方法已寫入國家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.7－2016，其中第三法用于甜菜中還原糖的測定，這種方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，但是操作較為復(fù)雜，而且用時(shí)較長。第一法具有操作簡單，滴定終點(diǎn)明顯的特點(diǎn)，當(dāng)還原糖含量大于0.25%，同樣適用于甜菜中還原糖的測定。滴定法的缺點(diǎn)是測定的是還原糖的總量而不能分別測定各種單糖的含量。

1.2 色譜法

色譜法包括氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等，最初曾經(jīng)使用薄層色譜技術(shù)分離出各種糖類，但是這種方法只能用來定性，而定量的準(zhǔn)確性很差。

1.2.1 氣相色譜法 葡萄糖和果糖不易揮發(fā)，所以在利用氣相色譜法測定之前，需要將提取液進(jìn)行衍生化處理，轉(zhuǎn)化為較易揮發(fā)的物質(zhì)。氣相色譜法常用的衍生化試劑包括甲基化類、酞基化類、三甲基硅醚化類等[10－11]。張海燕[12]等用氣相色譜法，氫火焰離子化檢測器（FID），DB－1701色譜柱，全乙酰化衍生的方法，測定了甜菜干粕中果膠中的6種單糖、2種醛酸的組成。該法過程較復(fù)雜，所花費(fèi)時(shí)間較長，且給糖類物質(zhì)定量也造成了較大的麻煩，所以目前應(yīng)用的不是十分廣泛，但是具有靈敏度高、檢出限較低的特點(diǎn)。

1.2.2 高效液相色譜法 氣相色譜法有較高的靈敏度，較好的分離效果，操作簡單等優(yōu)勢，然而該法對物質(zhì)的沸點(diǎn)和穩(wěn)定性有一定的要求，否則不可應(yīng)用此法。高效液相色譜法（HPLC）對樣品沒有太多要求，只要能夠制成溶液就可以進(jìn)行測定。因此，熱穩(wěn)定較差，沸點(diǎn)較高的物質(zhì)都能夠適用該法進(jìn)行測定分析。檢測器使用示差折光檢測器（RID），雖然靈敏度差，但可以快速檢測游離小分子糖[13]。具有樣品不被破壞可回收、重現(xiàn)性好、分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)，近年來已大量應(yīng)用于糖的測定。

董愛軍等[14]采用HPLC法測定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖，樣品采用C18固相小柱脫色凈化，正相色譜分析測定，色譜柱為 Agilent Zorbax Carbohydrate柱(4.6×250 mm，5 μm)，RID 檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葡萄糖在1～10 mg/mL、蔗糖10～100 mg/mL、棉籽糖在1～5 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9999、0.9999、0.9994。該分析方法簡便、準(zhǔn)確 、靈敏、重現(xiàn)性好，適用于糖蜜中糖類的檢測。許美彥[15]等采用HPLC法RID檢測器，測定了甜菜、糖漿及廢蜜中的的葡萄糖、蔗糖、棉子糖等7種糖類，為降低制糖過程中糖分損失和廢蜜的綜合利用提供了可靠的技術(shù)依據(jù)。

RID檢測器在糖類的測定中應(yīng)用較多，但是缺點(diǎn)是靈敏度較低，所需平衡時(shí)間長，對室內(nèi)溫度有較高的要求，容易引發(fā)波動等，而蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）卻能解決這些問題，可更好地進(jìn)行糖類物質(zhì)的測定[19]。由于甜菜基質(zhì)并不復(fù)雜，所以預(yù)計(jì)此方法可以在甜菜上應(yīng)用。

1.2.3 離子色譜法 離子色譜法作為一種新型的分析技術(shù)，其是利用高效的陰離子交換柱，搭配脈沖安培檢測器對樣品進(jìn)行分析。該法的靈敏度更高，有較好的選擇性，所需樣品少，且自動化能力強(qiáng)，然而有一個(gè)較大的缺點(diǎn)就是分析需要更多的時(shí)間[17]。王桂華等人[18]用此法測定了食糖中的還原糖，以氫氧化鈉為洗脫液，CarboPacTMPA10為交換柱進(jìn)行測定，結(jié)果表明該法對糖類有較好的分離效果，測定前的樣品處理相對簡單且有更高的靈敏度。劉曉玲等[19]用同樣的方法分析飲料中單糖也取得了較好的效果。

1.3 分光光度法（比色法）

1.3.1 3，5-二硝基水楊酸（DNS）分光光度法 還原糖在堿性條件下與3，5－二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)，還原糖被氧化成糖酸，3，5－二硝基水楊酸被還原為棕紅色的3－氨基－5硝基水楊酸，沸水浴中顯色5 min，540 nm波長進(jìn)行測定，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與顏色深淺成正比關(guān)系[20－21]。吳遜等[21]采用此方法測定了食品中的還原糖，方法標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、回收率均符合方法學(xué)要求。檢測結(jié)果與國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法基本一致。Santos等[22]改進(jìn)了DNS方法，利用微孔反應(yīng)板，把3，5－二硝基水楊酸加入微量試管，在微孔反應(yīng)板上進(jìn)行反應(yīng)，與傳統(tǒng)的方法相比，改進(jìn)的方法具有快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)。王俊剛等[20]、李淑貞等[23]探討了DNS方法測定蔗汁中的還原糖含量的測定條件，并與滴定法進(jìn)行了對比，具有操作簡便，準(zhǔn)確性較高的特點(diǎn)。此方法可以用于糖甜菜還原糖的測定，但是食用甜菜（如紅甜菜等）不能使用此方法。

1.3.2 2，4-二硝基酚分光光度法 本方法是基于2，4－二硝基酚與還原糖在堿性條件下，發(fā)生氧化反應(yīng)，溶液由淺黃色變?yōu)槌壬谝欢ǖ臐舛确秶鷥?nèi)，符合朗伯－比爾定律[24]。宋迪燊等[25]利用此方法測定了山楂片中還原糖的含量，方法的檢出限為0.013 mg/g，該法簡便快捷，較適合于常規(guī)生產(chǎn)中測定山楂片還原糖含量。但是與DNS方法相似，食用甜菜由于滴定終點(diǎn)不好觀察不適合使用此方法。

1.4 電化學(xué)法

近年來，為了實(shí)現(xiàn)葡萄糖的快速測定，研究最多、最熱點(diǎn)的就是葡萄糖傳感器。首個(gè)電極是將葡萄糖氧化酶固定在一個(gè)氧電極得到的，并運(yùn)用酶催化反應(yīng)來檢測氧氣的消耗，進(jìn)而測定葡萄糖的含量。葡萄糖傳感器最初用于檢測體內(nèi)葡萄糖，后來也被用于食品、生物加工及可持續(xù)燃料電池等方面，發(fā)展為無酶傳感器、貴金屬納米材料傳感器等[26－28]。田雅坤等[29－32]構(gòu)建了一種基于Au納米顆粒－氧化亞銅＠銅納米線的無酶葡萄糖傳感器，該電極對于在檢測葡萄糖方面具有更優(yōu)異的性能。線性關(guān)系在0.05～1.5 mmoL/L，同時(shí)具有較高的靈敏度［0.0001A/（mmol/L）］及較低的檢測限[5 μmol/L（S/N=3）]。 這種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)就是比較方便，隨時(shí)都可以測定，在甜菜收儲運(yùn)過程中，可以利用此方法監(jiān)測葡萄糖含量的變化，進(jìn)一步對甜菜品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測。

1.5 酶偶聯(lián)法

酶偶聯(lián)法測定甜菜塊根中的糖類，具有快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。Victoria等[33]利用此方法測定了甜菜塊根中的葡萄糖、果糖及蔗糖。將甜菜塊根薄片研磨后取100 mg在密閉容器中采用水和甲醇（20∶80 v/v）混合溶劑提取，水浴搖床70℃提取2 h，340 nm進(jìn)行測定，線性范圍為2.8～16.7 μg/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99。與其他方法相比這種方法的線性范圍不寬，測定蔗糖時(shí)需要稀釋倍數(shù)很大[34]，對準(zhǔn)確率會有一定的影響。

2 蔗糖的測定方法

2.1 旋光法

甜菜的糖類物質(zhì)中，蔗糖占的比例最高，一般用旋光法測定，測得的塊根蔗糖含量占鮮重的百分?jǐn)?shù)一般稱為糖度，具體的測定方法參照QB/T 5014。

2.2 色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法

HPLC法也可以用來測定蔗糖，還原糖的測定方法中有一些也可以測定蔗糖[14－15]。Shihao Sun等[35]分別使用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC－ELSD）、高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜（HPLC－ESI－MS/MS）、氣相色譜儀－質(zhì)譜（GC－MS）測定了大棗中8種小分子的碳水化合物，包括蔗糖、葡萄糖、果糖等，結(jié)果證實(shí)HPLCELSD與HPLC－ESI－MS/MS兩種方法的精密度及準(zhǔn)確度都較高。相比較而言，GC－MS方法不如前兩種方法，雖然線性范圍較寬，但是需要進(jìn)行衍生化，甜菜上蔗糖的測定推薦前兩種方法。

2.3 近紅外光譜法

近年來，近紅外光譜法已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、制藥和石化等各個(gè)行業(yè)，為現(xiàn)代生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[36]。利用被測樣品在近紅外區(qū)域的吸收，先測定大量樣品的參數(shù)值，建立校正模型，在進(jìn)行未知樣品的分類時(shí)，應(yīng)用已建立的模型和未知樣品的吸收光譜便可確定未知樣品中參數(shù)的濃度[36]。Pan L等[37]利用兩種便攜式近紅外光譜儀，對完整的甜菜塊根和甜菜切片，波長分別在400～1 100 nm和900～1 600 nm的范圍內(nèi)，獲得了可見光譜和近紅外光譜。建立了完整甜菜塊根和切片甜菜的蔗糖預(yù)測模型，并對模型進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：波長在400～1 100 nm預(yù)測的相關(guān)系數(shù)完整塊根和切片分別為0.80和0.88，預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.89%和0.70%，波長在900～1 600 nm預(yù)測的相關(guān)系數(shù)完整塊根和切片分別為0.74和0.88，預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.20%和0.69%。楊勇等[38]利用此方法，二極管陣列近紅外光譜儀（波長900～1 700 nm）對甜菜糖度的快速檢測進(jìn)行了系統(tǒng)研究，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9214，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.439，預(yù)測值和實(shí)測值之間不存在顯著性差異(p＞0.05)。近紅外光譜法作為一種簡單、快速、無損、環(huán)保的檢測方法，能夠良好地評價(jià)甜菜的糖度。

3 低聚糖、多糖的測定方法

甜菜中的低聚糖主要包括棉子糖（raffinose，也叫棉實(shí)糖）和蔗果三糖，以前者居多，所以我們這里主要討論棉子糖的測定方法。一方面，作為甜菜中的一種功能性低聚糖[39]，具有增強(qiáng)肌體免疫力等功效；另一方面，棉子糖在制糖過程中會妨礙蔗糖的結(jié)晶，并使蔗糖晶體成為針狀，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

目前，棉子糖的檢測方法主要包括 HPLC－ELSD（或者 RID）、離子色譜－脈沖安培法[40]、LC－MS[41－43]等檢測方法。由于棉子糖的極性稍大，采用高效液相色譜檢測時(shí)，一般都使用親水性液相色譜柱（正向柱），所以又叫親水作用液相色譜（HILIC）[44]。B Prandi等[45]以甜菜粕為原料生產(chǎn)果膠低聚糖（POS），采用HILIC－ESI/MS方法對POS的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了研究。陳凌霄等[46]利用高效液相色譜聯(lián)用電噴霧檢測器分析了不同植物中棉子糖系列寡糖，結(jié)果表明：供試品溶液RSD小于2.8%；低、中、高濃度供試品溶液的重復(fù)性RSD分別小于3.6%、3.8%和3.1%。對于甜菜中棉子糖的測定可以采用此方法及親水性液相色譜方法。

甜菜中的糖類還包括多糖，是從甜菜榨糖后剩下的甜菜粕中提取的，屬于極性復(fù)雜的大分子，提取、純化及測定方法比較復(fù)雜。一般采用熱水浸醇沉的方法提取甜菜多糖，利用Sevag法除蛋白質(zhì)，主要是除去體系中的游離蛋白質(zhì)，是將正丁醇和氯仿的混合液加入粗多糖溶液中，使游離的蛋白質(zhì)發(fā)生變性產(chǎn)生沉淀，通過離心分離去除，從而達(dá)到去除蛋白的目的[47]。然后采用活性炭對糖液進(jìn)行脫色。最后采用高效液相色譜－凝膠柱層析法，測定甜菜多糖的分子量。

4 小結(jié)

甜菜中單糖可采用滴定法、色譜法、分光光度法、電化學(xué)法及酶偶聯(lián)法，其中滴定法操作簡單，成本低，但是測定的是甜菜中還原糖的總量。要想測定每一個(gè)單糖的含量，需要應(yīng)用色譜法，氣相色譜法樣品測定之前需要進(jìn)行衍生化處理，但是靈敏度較高[10]；液相色譜前處理簡單，但是靈敏度及精密度都不及氣相色譜[9]；離子色譜前處理簡單，但是成本較高[17－19]；分光光度法只適用于糖甜菜，對于食用甜菜（如紅甜菜等）不適合[20－25]；電化學(xué)法只能測定葡萄糖[26－29]；酶偶聯(lián)法測定快速、高效，但是線性范圍較窄，準(zhǔn)確率會有一定的影響[33－34]。

蔗糖適用的分析方法有旋光法、高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用的方法及近紅外光譜法。其中旋光法是經(jīng)典的方法，比較簡單易行，但是靈敏度稍差；高效液相色譜法[14]采用正向柱，靈敏度及精密度好于旋光法；液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用則不受基質(zhì)的影響[35]，具有較高的靈敏度及精密度；近紅外光譜法具有簡單快速，操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)甜菜收購環(huán)節(jié)的定等分級和按質(zhì)論價(jià)，但是需要復(fù)雜的前期工作，需要先測出大量樣品的蔗糖含量準(zhǔn)確數(shù)值[36－38]。

低聚糖（主要是棉子糖）推薦采用親水性液相色譜及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用的方法。由于棉子糖的高極性，所以選用親水性液相色譜[44]進(jìn)行測定，精密度可以滿足要求；液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用三重四級桿質(zhì)譜的MRM掃描方式，能夠排除干擾，極大地提高信噪比，從而降低了前處理的難度[48]。