NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控

陳潤(rùn)娟，雷婭偉，白小明，袁承華，田彥鋒

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

白小明為通訊作者。

溫度作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，參與植物的新陳代謝、蒸騰作用、礦質(zhì)元素吸收，以及所有的酶促反應(yīng)、休眠和生長(zhǎng)發(fā)育[1]。溫度過低對(duì)植物的傷害是一個(gè)世界性的問題，也是農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境限制因子。在草坪產(chǎn)業(yè)中，低溫脅迫不僅影響草坪的綠期和質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)還能使草坪草植株死亡，導(dǎo)致建坪失敗。在我國(guó)北方，大部分地區(qū)冬季寒冷干旱，草坪草的安全越冬受到威脅，而春秋兩季氣溫不穩(wěn)定，寒流侵襲又使草坪經(jīng)常出現(xiàn)春季返青晚、秋季早衰的現(xiàn)象，致使草坪生長(zhǎng)不良，甚至嚴(yán)重退化，影響草坪的整體美觀，降低草坪的綠期和使用價(jià)值[2]。提高草坪草耐寒性的方法一是選育耐寒品種，二是通過施加外源物質(zhì)來提高其抗性。一氧化氮(NO)作為一種脂溶性和微水溶性小分子氣體，過去一直被認(rèn)為是有毒分子，直到1998年，諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了在動(dòng)物NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面做出突出貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家，此后人們逐漸發(fā)現(xiàn)作為一個(gè)非傳統(tǒng)的重要信號(hào)分子[3]，NO廣泛參與了植物體內(nèi)多種生理過程的調(diào)節(jié)，尤其在逆境條件下，其作用更為顯著[4-6]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為采自甘肅定西市安定區(qū)的野生草地早熟禾，采集地生境為山坡，海拔2 490 m，地理坐標(biāo)N 35°20.41′，E 104°05.26′。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中以亞硝基鐵氰化鈉(SNP，Sigama公司，分

析純)為NO供體(產(chǎn)生NO)，亞鐵氰化鈉(sodium ferrocyanide，縮寫為SF)為SNP類似物(不產(chǎn)生NO)，牛血紅蛋白(Hb)為NO清除劑，鎢酸鹽(tungstate，縮寫為T)為硝酸還原酶活性抑制劑，N-硝基-L-精氨酸甲脂(NG-nitro-L-Arg-methyl ester，L-NAME)為一氧化氮合酶抑制劑，以上化學(xué)試劑均購(gòu)于Sigma 公司。試驗(yàn)設(shè)13個(gè)處理(表1)。

表1 試驗(yàn)處理

供試材料幼苗培育采用盆栽沙培方式，花盆直徑11 cm，深11 cm。幼苗生長(zhǎng)3個(gè)月后選取長(zhǎng)勢(shì)整齊一致，無病蟲害的幼苗修剪至8 cm，進(jìn)行處理。各處理液用量為80 mL,用噴霧器噴施于供試材料葉面，用塑料薄膜覆蓋植株在20℃培養(yǎng)箱保濕2 h。連續(xù)噴施3 d,1次/d,第4 d將經(jīng)過處理的材料從培養(yǎng)箱中取出,在4℃智能型光照培養(yǎng)箱(SPX-300-GB，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))進(jìn)行低溫脅迫6 d(處理的第0、2、4、6 d進(jìn)行澆灌)，20℃為對(duì)照。每個(gè)處理4盆，重復(fù)4次，6 d 后取生長(zhǎng)一致的幼苗測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

(1)丙二醛(MDA)含量測(cè)定 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[14]。

過氧化氫(H2O2)含量，參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。

羥自由基(·OH)含量，參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

(3) 抗氧化物酶活性 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]的方法測(cè)定。

過氧化物酶(POD)活性，參照文獻(xiàn)[19]的方法測(cè)定。

過氧化氫酶(CAT)活性，參照文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定。

抗壞血酸氧化物酶(APX)活性，參照文獻(xiàn)[21]的方法測(cè)定。

谷胱甘肽還原酶(GR)活性，參照文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，Excel制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量的影響

4℃低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量顯著高于CK(P<0.05)，是CK的1.68倍，說明低溫脅迫促進(jìn)了葉片膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累。施入SNP后MDA含量明顯降低(P<0.05)，比4℃處理下降25.07%。低溫脅迫下施用牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME，葉片MDA含量顯著升高(P<0.05)，分別比4℃處理提高27.82%，23.19%和23.87%，添加SNP后膜脂過氧化程度降低，MDA含量均下降到了4℃處理水平，分別為14.00，13.83和13.57 μmol/g。亞鐵氰化鈉處理下草地早熟禾葉片MDA含量為14.54 μmol/g，與4℃處理無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA的影響Fig.1 Effect of nitric oxide on malondialdehyde content in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片自由基的影響

圖2 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片H2O2、·OH含量及產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effect of nitric oxide on the content of H2O2 and OH- and · emission rate in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

2.3 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、APX和GR等抗氧化酶是植物體ROS清除系統(tǒng)的重要組成部分，許多研究表明，低溫能引起氧化脅迫并且改變抗氧化酶的活性，NO能調(diào)控抗氧化酶活性，緩解氧化脅迫的傷害。低溫脅迫下草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性顯著增強(qiáng)，分別比CK提高了39.59%、69.26%、106.43%、71.15%，施入SNP后SOD、POD、APX和GR活性進(jìn)一步的升高(P<0.05)，分別比4℃低溫脅迫提高了31.87%、38.54%、64.66%、113.19%；低溫脅迫下牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME處理則抑制了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，再添加SNP則抑制作用被緩解，SOD、POD、APX和GR活性又增強(qiáng)。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾葉片中SOD、POD、APX和GR活性與CK相比則顯著提高，增幅分別37.55%、70.68%、122.62%、83.86%，與對(duì)應(yīng)的4℃低溫處理無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 NO對(duì)低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of nitric oxide on antioxidant enzymes activity in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

3 討論

NO作為植物中廣泛存在的一種正常代謝物和重要的信使分子,與非生物脅迫下植物體內(nèi)ROS代謝的調(diào)控有關(guān)，可以緩解各種脅迫造成的氧化損傷，增強(qiáng)植物的適應(yīng)能力[28]。劉開力等[29]報(bào)道，外源NO可通過提高水稻(Oryzasativa)幼苗根組織的抗氧化能力來緩解鹽脅迫下的氧化損傷。馬向麗等[30]研究證實(shí)，外源NO處理能顯著提高SOD，CAT和POD三者的活性，從而增強(qiáng)一年生黑麥草的抗冷性。本研究表明，SNP處理提高了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，增強(qiáng)了低溫脅迫下清除活性氧的能力，由于保護(hù)酶活性上升，清除有害自由基，MDA的生成減少，膜系統(tǒng)受到保護(hù)；另一方面，MDA的減少可能使保護(hù)酶的活性上升，增強(qiáng)膜系統(tǒng)保護(hù)酶的功能，兩者相輔相成。

亞鐵氰化鈉是SNP的類似物，在生物體中分解后除不產(chǎn)生NO外，其他的產(chǎn)物與SNP相同[31]。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾對(duì)MDA、自由基和抗氧化酶活性均無明顯影響，進(jìn)一步說明緩解低溫脅迫下草地早熟禾氧化損傷作用的物質(zhì)是NO，這與周萬海等[32]在苜蓿鹽脅迫上的研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

[1] 王代軍,溫洋.溫度脅迫下幾種冷季型草坪草抗性機(jī)制的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),1998,7(1):75-80.

[2] 梁慧敏,夏陽(yáng),杜峰，等.低溫脅迫對(duì)草地早熟禾抗性生理生化指標(biāo)的影響[J].草地學(xué)報(bào),2001,9(4):283-286.

[3] F rstermann U,Sessa W C.Nitric oxide synthases:regula-tion and function[J].Eur Heart J,2012,33(7):829-837.

[4] Zhang W L,Shen W B,Xu L L.Effect of nitric oxide on thesingalmolecularity[J].Chemistry of Life,2002,22:61-62.

[5] Durner J,Klessig D F.Nitric oxide as a signal in plants[J].Curr Opin Plant Biol,1999(2):369-374.

[6] Garcia M C,Lamattina L.Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress[J].Plant Physiol,2001,126:1196-1204.

[7] Zhao L，He J X，Wang X M，etal．Nitric oxide protectsagainst polyethylene glycol-induced oxidative damage in two ecotypes of reed suspension cultures[J]．Journal of Plant Physiology，2008，165:182-191.

[8] Beligni M V，Lamattina L．Nitric oxide protects against cellular damage produced by methylviologen herbicides in potato plants[J]．Nitric Oxide，1999，3(3):199-208.

[9] Song L L，Ding W，Zhao M G，etal．Nitric oxide protects against oxidative stress under heat stress in the calluses from two ecotypes of reed[J]．Plant Science，2006，171:449-458.

[10] 楊美森,王雅芳,干秀霞,等.外源一氧化氮對(duì)冷害脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)、抗氧化系統(tǒng)和光合特性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(15)：3058-3067.

[11] 徐洪雷,于廣建.一氧化氮(NO)對(duì)黃瓜低溫脅迫的緩解作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(5):606-608.

[12] 陳宇,林素英,黃志明,等.枇杷幼果內(nèi)源一氧化氮和茉莉酸對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2012,30(6):611-617.

[13] 魯存海,白小明.8種野生早熟禾種質(zhì)材料坪用特性和草坪質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].草原與草坪,2011(5):55-59.

[14] 鄒琦.植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[15] 陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社,2002:119-127.

[16] Velikova V,Yordanov I,Edreva A.Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain -treated bean plants[J].Plant Science,2000(151):59-66.

[17] Halliwell B,Grootveld M,Cutteridge J M C.Methods for the measurement of hydroxyl radicals in biochemical systems:deoxyribose degradation and aromatic hydroxylation[J].Methods Biochem Anal,1988,33:59-90.

[18] Giannopolitis C N,Ries S K.Superoxide dismutases.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiology,1977,59:309-314.

[19] Urbanek H,Kuzniak-Gebarowaka E,Herka.Elicatation of defense responses in bean leaves by Botrytis cinereapolygalac-turonase[J].Acta Physiologic Plant arum,1991,13:43-50.

[20] Beers Jr R F,Sizer I W.A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J].Journal of Biological Chemistry,1952,195:133-140.

[21] Nakano Y,Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].Plant and Cell Physiology,2015,22:867-880.

[22] Foyer C H,Halliwell B.The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts:A proposed role on ascorbic acidmetabolism[J].Planta,2016,133:21-25.

[23] 孫宗玖,阿不來提,齊曼.狗牙根新品種抗寒性評(píng)價(jià)及生理基礎(chǔ)的研究[J].中國(guó)草地,2003,25(4):25-30.

[24] Sharma P，Sharma N，Deswal R．The molecular biology of the low temperature response in plants[J]．Bioessays，2005，27(10):1048-1059.

[25] 杜永吉,于磊,孫吉雄,等.結(jié)縷草品種抗寒性和抗寒機(jī)理研究[J].草地學(xué)報(bào),2008,16(17).

[26] 樊懷福，郭世榮，焦彥生，等．外源一氧化氮對(duì)NaCl脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)、活性氧代謝和光合特性的影響[J]．生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27(2):546 -553.

[27] 蔡志全，曹坤芳，馮玉龍，等.夜間低溫脅迫對(duì)兩種生長(zhǎng)光強(qiáng)下藤黃幼苗葉片熒光特征和活性氧代謝的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003,14(3)：326-331.

[28] Arasimowicz M,Floryszak-W ieczorek J.Nitric oxide as a bioactive signalling molecule in plant stress responses[J].Plant Science,172:876-887.

[29] 劉開力，韓航如，徐穎潔，等.外源一氧化氮對(duì)鹽脅迫下水稻根部脂質(zhì)過氧化的緩解作用[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19(4):333-337.

[30] 馬向麗，魏小紅，龍瑞軍，等.外源一氧化氮提高一年生黑麥草抗冷性機(jī)制[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(6):1269-1274.

[31] Shi Q H，Ding F，Wang X F，Wei M． Exogenous nitric oxide protect cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress[J]． Plant Physiology and Biochemistry，2007，45:542-550.

[32] 周萬海,馮瑞章,師尚禮,等.NO對(duì)鹽脅迫下苜蓿根系生長(zhǎng)抑制及氧化損傷的緩解效應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35(11):3606-3614.

[33] Liu Y J，Jiang H F，Zhao Z G，etal． Nitric oxide synthase like activity-dependent nitric oxide production protects against chilling-induced oxidative damage in Chorisporabungeana suspension cultured cells[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2010，48:936-944.

[34] Liu Y G，Wu R R，Wan Q，etal．Glucose-6-phosphate dehydrogenase plays a pivotal role in nitric oxide-involved defense against oxidative stress under salt stress in red kidney bean roots[J].Plant and Cell Physiology，2007，48:511-522.

[35] Wang H H，Huang J J，Bi Y R．Nitrate reductase-dependent nitric oxide production is nvolved in aluminum tolerance in red kidney bean roots[J].Plant Science，2010，179:281-288.