多重PCR技術在致病菌檢測中的應用進展

吳科明

（防城港市疾病預防控制中心 廣西 防城港 538021）

致病菌污染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，也是影響食品安全的最主要原因之一，能及時，準確地檢出致病菌是社會發(fā)展的需求[1]。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法是微生物的“金標準”，但培養(yǎng)法一般需要經(jīng)過前增菌或增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學鑒定等幾個步驟；整個檢測過程繁瑣、耗時長、工作量大,一般需要4～7d才能出檢測結果[2-3]。近年來，PCR技術發(fā)展十分迅速,它具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點，其中的多重PCR是通過對PCR技術的改進而建立起來的一種體外擴增技術，是在同一擴增體系中通過加人多對引物從而對多條目的DNA片段進行擴增，具有能一次性檢出多種致病菌、靈敏度高、特異性強、快速的優(yōu)點,并且隨著研究的深入和發(fā)展，多重PCR技術在致病菌中的應用領域也越來越廣泛[4-5]。

1.多重PCR在致病菌檢測的概念和特點

多重PCR是在同一PCR反應體系里加入兩對或兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的PCR反應,多重PCR技術已被廣泛應用于核酸診斷的許多領域，包括基因敲除分析、突變和多態(tài)性分析、定量分析及RNA檢測等。利用一次多重PCR反應，可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有獨特的優(yōu)勢和極高的實用價值[6]。

多重PCR能一次性檢測多種病原微生物或對同一致病原微生物多種分型和毒力，有較強的高效性、靈敏度；如增菌可在24小時內得出結果，不增菌可在3～5小時內得出結果，自動化程度高，檢出時間短,操作簡單，試劑成本相對低，適合檢測成組病原微生物[7-8]。

2.多重PCR在致病菌檢測中的應用

2.1 用于檢測一種或多種不同的致病菌

針對每一種病原的單個特異基因進行多重檢測，不同病原菌高度保守基因、特異性基因和毒素基因設計相應的引物，可同時檢測一種或幾種病原體的存在與否，進行PCR擴增時，在同一PCR反應管中同時加入多種病原微生物的特異性引物，能夠同時檢測多種病原體。李爭等[9]利用大腸埃希菌0157：H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE設計2對引物建立微量快速檢測大腸埃希菌0157：H7的多重PCR方法,經(jīng)驗證該方法特異性、靈敏性和重復性均良好。祝巖波等[10]根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因、綠膿桿菌LasI基因、肺炎克雷伯桿菌PhoE基因和細菌通用16SrRNA基因設計出特異性引物；經(jīng)過多重PCR引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，特異性和敏感性的檢測，建立多重PCR體系。吳建英等[11]以金黃色葡萄球菌nuc基因、產(chǎn)單核李斯特菌hlyA基因和沙門菌invA基因設計的特異引物，通過多重PCR對上述3種食源性致病菌的目的基因進行擴增，同時對反應體系進行優(yōu)化,認為濃度分別為160、80和40nmol/L時為實驗的最佳濃度，結果顯示本實驗的檢出限為5cfu/ml，具有簡便、快速、經(jīng)濟，具有較好的應用前景。李洋洋等[12]為了建立同時檢測嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的多重PCR方法，根據(jù)阪崎腸桿菌ompA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、蠟樣芽孢桿菌hblA基因分別設計3對引物進行多重PCR擴增，結果多重PCR擴增出長度為514、156、235bp的特異性目的條帶，不增菌的情況下，多重PCR同時檢測3種病原菌的靈敏度是103cfu/mL，準確、快速、高效，為同時檢測嬰幼兒奶粉中的病原微生物檢測提供了新方法。陳娟等[13]根據(jù)沙門菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的16SrDNA基因、大腸桿菌O157∶H7的eaeA基因、單核增生李斯特菌的hlyA基

因和福氏志賀菌的ipaH基因設計5對特異性引物進行多重PCR檢測，對反應條件包括鎂離子濃度、引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化試驗，最佳反應條件為金黃色葡萄球菌、沙門菌和福氏志賀菌引物濃度為0.25μmol/L，單核增生李斯特菌引物濃度為0.4μmol/L，大腸桿菌0157：H7引物濃度為0.3μmol/L，Mg2+濃度為2.25mmol/L，退火溫度為60℃；在此條件下5種病原微生物的多重PCR的DNA檢出限分別為6.4、32、32、800和160pg,對實際應用有指導意義。

2.2 用于同一病原微生物的毒力、分型等的檢測

傳統(tǒng)方法進行致病菌的毒和力分型檢測等，一般采用增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定、和血清學試驗等步聚，整個檢測過程存在工作量大、檢測周期長、工作繁瑣、操作和判定不容易、成本高等缺陷。而多重PCR在同一反應管內同時對多個目的基因進行擴增分析，檢測更簡便，靈敏度、特異性更高，耗時更短等特點。林佳琪等[14]分別以副溶血性弧菌的toxR、tdh、trh、tlh4個基因為靶基因，設計4對特異性引物，對4對引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化，獲得最佳引物比例和擴增條件，建立快速檢測致病性副溶血性弧菌的四重PCR體系,該方法可實現(xiàn)同時檢測攜帶toxR、tdh、trh、tlh4種基因的副溶血性弧菌，對開展致病性副溶血性弧菌的檢測研究具有一定現(xiàn)實意義。孟慶美等[15]建立禽致病性大腸桿菌黏附相關基因、侵襲及毒素相關基因、抗血清存活相關基因及鐵轉運相關基因的多重PCR方法，實現(xiàn)禽致病性大腸桿菌毒力基因的簡便、快速檢測。倪奕弘等[16]對引起人類和動物腸道內或腸道外疾病的6種病原型大腸桿菌的47個毒力基因，采用多重PCR方法對38株大腸桿菌和4株志賀氏菌進行毒力基因的分布調查及系統(tǒng)進化分類。劉琪等[17]建立的多重PCR檢測方法分別對豬鏈球菌血清2型、7型和9型擴增出特異性片段，片段大小分別是360、600、800bp。該方法特異性良好，與豬鏈球菌其他29個血清型均無交叉反應，可應用于實驗室的快速診斷以及豬鏈球菌的流行病學調查。任斌[18]根據(jù) Genbank已報道的porinⅠ基因序列，設計合適的擴增引物和porinⅠ基因類型檢測引物，運用多重PCR技術對確診的浙江地區(qū)的奈瑟淋球菌臨床菌株進行檢測和類型分析，結果在分析的43株確診的奈瑟淋球菌臨床菌株中，建立的多重PCR法對porinⅠ基因檢出率為100%，對porinⅠ基因分型正確率為95.35%，能用于奈瑟淋球菌臨床株porinⅠ基因的的快速檢測和分型。彭拓華等[19]分別采用多重PCR和莢膜腫脹試驗對568株肺炎鏈球菌進行血清分型，568株肺炎鏈球菌中，213株通過莢膜腫脹試驗分出13個血清群分型率為37.5%（213／568），356株通過多重PCR分出21個血清群,分型率為62.7%（356／568）,多重PCR的分型率高于莢膜腫脹試驗。

2.3 用于致病菌耐藥基因的檢測

致病菌易出現(xiàn)變異菌株，其中最常見的是耐藥性轉移，但傳統(tǒng)的藥物敏感試驗操作繁瑣，時間比較長，很難及時得到致病菌的敏感抗生素，導致了臨床上抗生素的濫用，一定程度上加速了耐藥菌及多重耐藥菌的出現(xiàn)。應用多重PCR方法可以同時對病原菌進行多種耐藥基因的篩選,方便快捷地得到相關致病菌的耐藥資料。王江元等[20]用多重PCR檢測鮑曼不動桿菌6種耐藥基因，并統(tǒng)計分析82例鮑曼不動桿菌耐藥基因與相應抗生素的關聯(lián)，比對耐藥基因檢出率及抗生素耐藥率對應情況,結果多重PCR檢測鮑曼不動桿菌靈敏性高、穩(wěn)定性強；可盡早、快速、高效地指導臨床用藥。趙彩蕓等[21]對250株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經(jīng)多重PCR方法檢測SCCmec基因型分型，主要對無功能區(qū)不同位點處的基因進行復合擴增，該方法是根同時擴增出現(xiàn)的多條帶形成的譜型來判定不同的型別。戰(zhàn)曉微等[22]為了解食源性金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及對氨基糖苷類慶大霉素、卡那霉素抗生素的耐藥性情況，并建立快速檢測鑒定金黃色葡萄球菌耐藥性多重PCR方法,利用所建立的方法檢測72株食品及食物中毒患者來源的金黃色葡萄球菌,72株金黃色葡萄球菌均有nuc基因檢出，mecA基因與MRSA檢測符合率達100%，aacA－aphD、aph(3')－Ⅲa基因與慶大霉素、卡那霉素耐藥菌株的符合率達95.12%。

3.多重PCR檢測致病菌的影響因素和應用前景

多重PCR雖為一種特異靈敏、簡便快速、高通量的檢測技術，但其在實際應用中也存在問題，污染問題就是其中之一,有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結果[23]；在多重PCR試驗中,發(fā)現(xiàn)在條件優(yōu)化不好的情況下會產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物和引物二聚體,這跟引物擴增基因和擴增條件有關系。同時，多對引物同時擴增，各種實驗條件控制不當，很容易導致擴增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設計及靶序列的選擇不當?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性[24]。

多重PCR雖然存在一些問題，但傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低、特異性不高、操作繁瑣、耗時長等問題的相對于多重PCR操作簡單、快速,具很高的特異度和敏感高的優(yōu)勢是不可比擬的, 多重PCR極大減輕了工作量和提高了工作質量,為快速檢測和鑒定常見致病菌提供了有效的手段,可以推廣應用于水源檢測、環(huán)境監(jiān)測、商品檢驗檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)督等領域,具有較廣闊的應用前景和較大的經(jīng)濟與社會效益[25]。

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